电镜生物样品制备程序.docVIP

透射电镜包埋切片样品制备程序： 样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品： 1、漂洗：倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； 2、锇酸固定：用1%的锇酸溶液固定样品1-2h； 3、再漂洗：取出固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； 4、乙醇梯度脱水：用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理20min；最后用纯丙酮处理20min。 5、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h；②用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；③纯包埋剂渗透样品过夜：这一步要将样品转移到干燥的新管中，该新管中放入纯的包埋剂 6、将经过渗透处理的样品分装到0.5ml的eppendorf管中包埋起来，70℃加热过夜。 将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min，即可在透射电镜中观察。 需前处理的SEM样品制备程序 样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品： 倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； 用1%的锇酸溶液固定样品1-2h； 倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； 用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20 min。 用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V/V=1/1）处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1-2h。 临界点干燥。镀膜，观察。处理好的样品在扫描电镜中观察。 表1 戊二醛溶液的配制 终浓度 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0 0.2M PBS/ml 50 50 50 50 50 50 50 25%戊二醛水溶液/ml 4 6 8 10 12 16 20 重蒸水加至/ml 100 100 100 100 100 100 100 表2 0.2M磷酸缓冲液（PBS）的配制 A液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 B液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液 Na2HPO4 28.4g 或Na2HPO4.H2O 31.61g 或Na2HPO4.2H2O 35.6g 或Na2HPO4.7H2O 53.63g 或Na2HPO4.12H2O 71.64g 加双蒸水至1000mL NaH2PO4 24.0g 或NaH2PO4.H2O 27.6g 或NaH2PO4.2H2O 31.21g 加双蒸水至1000mL 按下表比例混合A、B液后，配成0.2mol/L的母液，其中pH7.0为常用配方 pH值 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 A液 8.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.0 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7 B液 92.0 87.7 81.6 73.5 62.5 51.0 39.0 28.0 19.0 13.0 8.50 5.30 在缓冲液中加入葡萄糖，蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。 表4 2%锇酸溶液的配制 试剂 用量 锇酸/g 1 重蒸水/ml 50 2%的锇酸溶液使用之前需用0.2MPBS稀释成1%的锇酸溶液。 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。 醋酸异戊酯挥发性较强，应在通风橱中操作，废液用密闭容器装好后丢弃。