缝隙连接蛋白43在缺血后适应心肌保护中作用及研究.pdfVIP

第九次全国中西医结合血瘀证及活血化瘀研究学术大会 缝隙连接蛋!兰143在缺血后适应心肌保护中作用的研究 李楠魏冯宁 李丽亚张冬芹 董道然 朱丹 曾玉杰 卫生部中日友好医院心内科(北京，100029) 近几年缺血后适应(ischemia 到关注。iPC最p指心肌缺血后，在长时间的再灌注之前进行的数次短暂缺血／再灌注的循环，以此来减轻 有效。但关于其作用机制的研究却越来越多。重要原因就是其作用点涉及面广，各个方面又相互影响。 再灌注过程中细胞的存亡与细胞间通讯条件的改变密切相关。细胞间的通讯有赖于缝隙连接(gaP junction，GJ)，缝隙连接是位于细胞膜表面的蛋白六聚体，这些蛋白被称为GJ蛋白或者通道蛋白 的小鼠无法诱导出缺血预适应的心肌保护作用，提示GJ参与了缺血预适应的心肌保护过程。IPC与预适 应有几乎相同的信号传导通路，提示Cx43可能也参与IPC的保护作用。相对于Cx43形成的缝隙连接，最 何，它与己知的IPC信号通路之间有何联系，Cx43的磷酸化状态在IPC中有何变化。基于以上问题，本研 ATP—sensitive 响，探讨Cx43在IPC心肌保护作用中的可能机制。 实验材料及方法 一、实验动物、主要仪器及试剂sD雄性大鼠，260～3109，由北京大学医 Bio GAPDH多克隆抗体、(美[]Santa West 有限公司)、SuPerSignal 洋生物制品科技有限公司)、DAB显色液(丹麦DAKO公司)。 二、在体大鼠心脏缺血后适应模型制作 第九次全国中西医结合血瘀证及活血化瘀研究学术大会 大鼠术前心电图检查，心电图异常者剔除。1％戊巴比妥腹腔麻醉，背位固定。气管插管，接呼吸机， 持续正压通气，潮气量1～1．5ml／lOOg，频率70--80次／分，呼：吸比为2：l，压力在5～15cmH20。监测 心电图。于胸骨左缘约0．5am处切开皮肤约2cm，第四肋间钝性分离肌肉，暴露胸腔，生理盐水棉球保护 肺脏，剪开心包，暴露心脏，寻找动脉圆锥与左心耳根部间的左冠状动脉主干，穿线备用。稳定lOmin 后记录心电图，用fl$,J结扎器进行左冠状动脉缺血，结扎即刻记录心电图，以左室前壁呈紫绀或蓝紫色 及心电图导联s—T段弓背向上抬高大于0．1mv或高尖T波为结扎成功标志。具体分组为A．对照组：开胸， 左冠状动脉穿线，不结扎；B．IR组：缺血30min后再灌注180min；C．IPC组：缺血30min，再灌注10S， 缺ffⅡ10 置成混悬液)灌胃，缺血30 min。 理盐水配制)，缺血30min，再灌注10S，缺血10S，连续3个循环，再灌注179 三、心率和心律失常监测 自实验前到再灌注结束连续观监测心电图肢体导联信号，记录术前正常心电图及术中出现的心律失常 类型、出现时间及发生率。实验期间如发生大鼠死亡，则剔除，并重新实验补足至16只。以再灌注期间 的心律失常发生率作比较，评估不同处理组对减轻IR损伤的作用有何不同。 四、cl【、LDH、NO、MI)A的测定 用试剂盒按说明检测胁A和N0。 五、心肌梗死范围的测定 再灌注结束后结扎左冠状动脉前降支，将l％伊文思蓝Iml直接注入左心室腔，待蓝染后将心脏剪下， 4℃生理盐水清洗、吸干后立即放在一20℃冰箱冷冻1h后，自心尖向心底平行房室沟方向将心脏切成相等 TTC溶解于lOml 厚度的5片，放入1％TTC(O．19 去除右心室部分。TTC可以被活细胞中的具有还原活性的酶(主要是琥珀酸脱氢酶)还原生成粉红色的还原 产物，所以活组织部分呈现暗红色，而死亡细胞的还原酶的活力已经消失，不能被TTC还原，所以坏死组 (红色和白色)和左室面积(红色、白色和蓝色)，心肌梗死范围(％)=梗死面积／左室总面积×100 ％。 六、免疫组化染色 再灌注3h结束后，迅速取出心脏，置于冰生理盐水中，洗净残血，滤纸吸干，取左心室结扎点垂直 于心脏长轴切开，取结扎点以下心肌组织置于10％甲醛溶液中固定，制作石蜡包埋的切片，常规脱蜡，按 免疫组化试剂盒说明操作。高温2min修复抗原。DAB显色后，苏木素复染细胞核。常规脱水、透明、封片， 光镜下观察Cx43分布情况。 七