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实验项目 重组质粒DNA的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测 实验项目类型：性 所属课程名称：《》 实验计划学时：学时一、实验目的DNA的碱裂解方法。学会用酶切法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。 二、实验原理 1、提取质粒原理 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0(12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。 2、质粒DNA的酶切鉴定原理 利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。 三、实验材料与仪器?1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。 2、试剂 pGEM-T-AT8载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。EcoR I，Xba I， Sac I ，Xho I，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲 ?四、操作步骤 氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20(C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200(L 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121(C 20min灭菌）； 溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）； 溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）； 溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml），70%乙醇（-20(C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121(C 30min）。 2、操作步骤 1）制备质粒DNA （1）5ml LB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。 （2）pET-his载体的菌种和pGEM-T-AT8载体菌种（挑白色克隆！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37(C摇床中摇20h。 （3）? 1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。 （4）??100(l 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。） （5）???200(l 溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。 （6）??150(l 预冷的溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。 （7）??15000rpm5min，小心吸取400(l 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800(l 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。 （8）??15000rpm10 min，小心弃掉上清液，加入500(l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净 （9）???500(l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净 （10）?37(C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。 （11）??30(l 无菌蒸馏水或TE缓冲液； 3管pET-his质粒中每管加入10(l蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在pET-his质粒中加入1(l RNaes A。用记号笔标记后放入冰箱中备用。 （12）电泳检测 2）酶切 （1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中： pGEM-T-AT8（质粒D