全长cDNA文库及构建方法与应用进展.pdfVIP

重庆 医学 2011年 6月第4O卷第 16期 1639 · 综 述 · 全长 cDNA文库及构建方法与应用进展 韩慧霞 综述 ，陆洪光 ，王 鲁 审校 (1．贵阳医学院附属医院皮肤科，贵州贵阳550004；2重庆市第一人 民医院皮肤科 关键词 ：DNA，互补 ；基 因组文库 ；实验 室技术和方法 doi：10．3969／j．issn．1671-8348．2011．16．034 文献标识码 ：A 文章编号 2011)161639—04 互补DNA (complementaryDNA，cDNA)文库是指生物不 的文库在建库效率、全长 比例和代表性等方面都有所提高，；。 同生长发育时期 ，特定组织或器 官所转录的全部 mRNA经反 2004年 Clepet等 用 T DNA连接酶替代 T RNA连接酶， 转录形成 的 eDNA与载体连接后形成的克隆的集合 ，cDNA 文 在一定程度上提高 了寡核苷酸 mRNA 的连接效率 ，提高 了文 库是在基 因组水平上研究某一生物特定器官、组织和发育时期 库全长比例。同年 Ota等 用此法完成 了 21243条 日本人 基因表达 的前提和基础 。全长 cDNA文库是生物体 内完整 cDNA文库 的构建和测序 ，所构建文库 中大约有 85 的克隆 的mRNA分子反转录而获得 的DNA分子群集 ，是 mRNA分 为全长 。Kim等 改 良此法 ，提 出RNA 连接酶介导的 cDNA 子群 的一个完整 的拷 贝。全长 cDNA文库不仅提供完整 的 末端快速扩增 (RNA ligase—mediatedrapidamplificationofcD mRNA信息，而且可 以通过基 因序列 比对得到 mRNA剪接信 NAends，RLM～RACE)。2006年 Sunderland等[。用 RIM— 息 ，此外 ，还可以对蛋 白质序列进行预测及进行体外表达和通 RACE确定拟南芥 LIG1基 因所有 可能的转 录起 始位点。 过反向遗传学研究基因的功能等 。全长 cDNA 文库 的优点 2009年 Tsuchihara等一 将 Oligo—capping法与大规模平行测 明显，克隆大部分是全长 的，有效提高了基 因测序和生物信息 序技术结合 ，提 出以高通量方式收集转录起始位 点(transcrip— 学分析的进程，利于后期蛋 白质表达及功能分析 。目前几乎所 tionstartsites，TSS)信息和定量分析转录物表达水平 的方法 。 有构建全长 eDNA文库的方法都是基于真核生物完整 mRNA 改 良后 的Oligocapping法被广泛用于实验研究 。SumioSuga— 的一个共 同特征一 一“帽子”结构 ，即 mRNA 的 5端存在 的 no实验室利用此法不断完善人类基 因转录起始位点数据库和 m GpppNp结构 。多数 eDNA文库构建过程大致为分离总 全长 cDNA文库 ，通过对选定人类和小 鼠cDNA5端 的测序 ， RNA，纯化 utRNA，反转录成 cDNA，然后与两端带有限制性 获得 3．3亿新标签E1 ]。 酶切位点的人工接头相连接 ，并将其插入到载体 中，转染大肠 2 SMART法 杆菌 ，得到 cDNA文库 。近年来全球众多学者一直在有计划 、 RNA『反转录 5末端交换机制 (switchingmechanismat5 大规模地进行一些重要模式生物 的全长 cDNA 文库的构建及 endofRNA transcript，sMART)是在第一链合成时使用专利 研究 ，如拟南芥 、水稻 、果蝇 、小 鼠及猪 等 ]，这些生物全长 SMARTIV 寡核苷酸产生大量全长双链 cDNA。此法是在 cDNA文库 已构建完成 ，得到大量有重要价值 的数据 。本文主 PC