分子生物学与细胞生物学实验基本技术..docVIP

分子生物学与细胞生物学实验基本技术 2005-02 实验一 组织块培养法 一、目的 学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。 二、概述 组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例） 三、材料 仪器 净化工作台 恒温水浴箱 冰箱（4℃、-20℃） 倒置相差显微镜 培养箱 玻璃器皿 培养皿（Φ100mm） 吸管（弯头） 烧杯（500ml、200ml、10ml） 广口试剂瓶（500ml） 玻璃瓶（250ml、100ml） 培养瓶 废液缸 塑料器皿 吸头 枪头 胶塞 EP管 其他物品 微量加样枪 眼科组织剪（直尖、弯） 眼科组织镊（直、弯） 12.5cm组织镊（无钩、1×2钩） 25cm敷料镊（无钩） 止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式） 解剖剪 试剂 D-Hanks液 小牛血清 RPMI1640 双抗（青霉素、链霉素） 1N HCl 7.4%NaHCO3 四、操作步骤 取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。 组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块及杂组织等。 平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。 剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。 贴块：将剪切好的组织小块，用眼科镊送入培养瓶内，用弯头吸管将组织块均匀摆置，每小块间距0.5cm左右，组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量含10%牛血清培养液，盖好瓶盖。 培养：将培养瓶瓶底朝上，37℃培养箱放置2～4h，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。 换液：原代培养3～5d，需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞。 组织块培养法也可不用翻转法，即在摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可，盖好瓶盖，放置37℃培养箱24h再补加培养液。 注意事项 取材的组织最好尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。 从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含500～1000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗5～10min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。 组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄层血清、胎汁或鼠尾胶等。 原代培养的1～2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。 审 实验二 消化培养法 一、目的 学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养 二、概述 此法采用消化分离法（即结合生化和化学手段把已剪切成小体积的组织进一步分散的方法），将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，可直接进行培养。分散后细胞易于从外界吸收养分和排出代谢产物，容易生长，存活率高，可以很快得到大量活细胞，细胞在短时间内生长成片。由于各种消化试剂的作用机制各不相同，要根据组织类型和培养的具体要求选择消化方法和试剂。本方法适用于培养大量组织，原代细胞产量高，但步骤繁琐，易污染。（本节以乳鼠心肌细胞培养为例） 三、材料： 仪器 净化工作台 离心机 恒温水浴箱 摇床（37℃） 冰箱（4℃、-20℃） 倒置相差显微镜 培养箱 玻璃器皿 培养皿（Φ100mm） 吸管（弯头、直头） 烧杯（200ml、10ml） 玻璃瓶（250ml、100ml） 玻璃漏斗 培养瓶 废液缸 塑料器皿 吸头 枪头 胶塞 15ml离心管 EP管