博苑生物SDSPAGE蛋白条带酶解和质谱鉴定完整操作流程.pdf

SDS条带蛋白酶解及质谱鉴定完整操作流程 仪器： ABI 4800 MALDI-TOF/TOF 串联质谱仪(ABI)、真空冷冻干燥机、水浴锅、 Mascot 分析软件、移液器、离心管 主要溶液配置： 脱色液：25mM NH HCO 、50%乙腈的水溶液 4 3 脱水液 1：50%的乙腈溶液 脱水液 2 ：100%的乙腈 还原液 1：含10mM DTT和25mM NHHCO 的水溶液 4 3 还原液 2 ：50mM碘乙酰胺和25mM NH HCO 的水溶液 4 3 吸胀液：25mmol/L NH HCO 的水溶液 4 3 酶解覆盖液：25mM的NH HCO 、10%乙腈的水溶液 4 3 酶解工作液：含 0.02ug/ul 胰蛋白酶的酶解覆盖液 蛋白萃取液：含5% TFA、67%乙腈的水溶液 - 1 - 蛋白质酶解： 1、将切取的蛋白胶点转入0.5ml进口离心管中，采用超纯水漂洗两次， 2 、加入考染脱色液，脱色30min， 3、吸出脱色液，加入脱水液1，脱水30min， 4 、吸出脱水液1，加入脱水液2 ，脱水30min，真空冻干， 5、冻干的胶块加入50uL还原液1，57℃温浴1h， 6、吸出液体，加入50ul还原液2，室温放置30min， 7、吸出液体加入吸胀液，10min 8、吸出吸胀液，加入脱水液1，脱水30min， 9、吸出脱水液1，加入脱水液2 ，脱水30min， 10、吸出脱水液2 ，加入10ul酶解工作液，吸胀30min， 11、加入20ul酶解覆盖液，37℃水浴酶解过夜， 12 、酶解后上清转移至另一新离心管中， 13、加入50ul蛋白萃取液于剩下的胶中，37℃水浴30min，5000g离心5min， 合并上清，冻干后待做质谱。 - 2 - 质谱操作及数据库检索： 1、将干粉重新溶解于5ul含0.1TFA的溶液中，然后按照1：1的比例与含50%ACN 和1%TFA的α-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液混合， 2、取1ul样品进行质谱点靶鉴定，仪器为API4800串联飞行时间质谱仪 （MALDI-TOF/TOF）（Applied Biosystems）， 3、采用正离子模式和自动获取数据的模式进行数据采集；PMF的质谱扫描范 围为800-3500 Da；选择强度最大的10个峰进行二级质谱， 4、将一级和二级质谱数据整合并使用GPS 3.6（Applied Biosystems）和 Mascot2.1(Matrix Science)对质谱数据进行分析和蛋白鉴定， 5、搜索参数如下：数据库为NCBInr；酶为胰蛋白酶；允许最大漏切位点 为1；固定修饰为：Carbamidomethyl (C)；可变修饰为：Oxidation (M)； MS tolerance为0.15Da, MS/MS tolerance 为：0.25Da. Protein score C.I.% 大于95为鉴定成功。 - 3 -