组织羟脯氨酸含量微量测定方法和应用.pdfVIP

· 836。 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2004Jul：20(7)：836～7 组织羟脯氨酸含量微量测定方法及应用 杨秀颖 ，杜冠华 (中国医学科学院药物研究所 ，北京 100050) M icro volumeassay method ofhydroxyproline in 病理过程 ，特别是筛选抗纤维化的药物，具有重要意义。本 animaltissuesandapplication 文介绍一种微量羟脯氨酸测定方法以及对小 鼠肺组织 中羟 rANG Xiu—ying，DU Guan—hua 脯氨酸含量的测定结果。 (InstituteofMateriaMedica，ChineseAcadem)ofMedicalSci— 1 材料与方法 encesandPekingUnionMedicalCollege，Belting 100050，Chi一 1．1 试剂 羟脯氨酸 (hydroxyproline，Hyp)为 J．H．Baker 加 、 chemicalCO产品，其他试剂均为国产分析纯试剂。所需溶液 中国图书分类 号：R322．35；341．7；R575．202；R977； 具体配制方法见参考文献 。 R 977 4 1．2 标准 Hyp的测定 取标准 Hyp(20 g·L～，应用液 文献标识码 ：A 文章编号：1001—1978(2004)07—0836—02 及不同浓度的稀释液)25 l，柠檬酸缓冲液 25 l，0．05mol 关键词：羟脯氨酸；测定方法；肺组织 · L 氯胺 T50 l，加入96孔微板 中，室温氧化4min。加 Keywords：hydroxyproline；determination；lungtissue 3．15mol·L 高氯酸 50 l终止氧化反应 5min，再加入 10％PDAB50 l。透明胶带封严，烤箱内95℃反应20min， 羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)是机体胶原蛋 白的主要 冰上冷却后酶标仪测定A 。 1．3 肺组织 Hyp的测定 取小 鼠肺组织 ，去掉周 围结缔组 成分之一，在正常胶原蛋白中含量约 13．4％，在弹性蛋 白中 织。浸泡在 10％(V／V)甲醛中固定过夜 ，丙酮浸泡8h，更换 含量极少，而在其它蛋 白则不存在。因此，不同组织中Hyp 新鲜丙酮过夜，再更换 乙醇：乙醚 (1：1)过夜。60℃干燥至 含量可作为衡量其胶原组织代谢的重要指标。肺纤维化时， 恒重 。 肺组织 内胶原纤维量增加。由于羟脯氨酸为胶原纤维所特 每一样品取 6—12mg，EP管 中用玻璃棒研磨碎 。加入 有，以此作为肺纤维化的指标，可以判断纤维化程度 。 0．3ml纯水、0．3ml浓盐酸离心混匀。EP管盖上用针头扎 目前国内外有多人报道了羟脯氨酸的测定方法 ，但组织 一 小孔，置入高压锅 中，120℃水解 2h。取出后 40％ NaOH 需要量和样品测定体积均较大，不适合进行大规模的筛选实 调 pH至6左右