环境微生物学综合性实验指导书.doc

环境微生物学综合性实验指导书 适用专业：环境科学 指导老师：陶雪琴，郭琇 仲恺农业工程学院 环境科学与工程学院 二零零九年九月 多管发酵法测定水粪大肠菌群 一、实验目的和要求 掌握多管发酵法测定水中总大肠菌群的技术。 掌握多管发酵法测定水中粪大肠菌群的技术。 二、原理 总大肠菌群和粪大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。 多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便。在44.5℃温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。用提高培养温度的方法，造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。 培养基和试剂 EC 培养液：20g胰胨5g乳糖1.5g胆盐三号4g磷酸氢二钾（K2HPO4）1.5g磷酸二氢钾（KH2PO4） 5g氯化钠加热溶解1000mL蒸馏水然后分装于含有玻璃倒管的试管中。置高压蒸汽灭菌器中，115灭菌20min。灭菌后pH 应为6.9。4.1 水样接种量 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。 相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表1。 表1 接种用水量参考表 水样种类 检测方法 接种量（mL） 100 50 10 1 0.1 10-2 10-3 10-4 10-5 井水 多管发酵法 × × × 河水、塘水 多管发酵法 × × × 湖水、塘水 多管发酵法 × × × 城市原污水 多管发酵法 × × × 如接种体积为10mL，则试管内应装三倍乳糖蛋白胨培养液5mL，如接种量为1mL或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中。 初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃下培养24h±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。 4.3 复发酵试验 轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。 5 结果的计算 6 实验数据处理 6.1.接种用水量 水样种类 检测方法 接种量（mL） 100 50 10 1 0.1 10-2 10-3 10-4 10-5 多管发酵法 6.3 总大肠菌群数的结果 初发酵出现阳性管数 复发酵出现阳性管数 接种量最大的一管mL) 每100ml水中粪大肠菌群数MPN值 1L水中大肠菌群数 10 mL管 1 mL管 0.1L管 10mL 1mL 0.1 m10 mL管 1 mL管 0.1 mL管 6.4 粪大肠菌群数的结果 初发酵出现阳性管数 复发酵出现阳性管数 接种量最大的一管（mL） 每100ml水中粪大肠菌群数的MPN值 1L水中粪大肠菌群数 10 mL 管 1 mL 管 0.1 mL 管 10 mL 管 1 mL 管 0.1mL 管 6.3 依据《地表水环境质量标准，判断你测定的水样属于几类水？ 附表： 表2 大肠菌群检数表 接种水样总量300mL(100mL2份，10mL10份) 附表 表3 最可能数(MPN)表 （接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，不同阳性及阴 性情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95%可