恶性胸膜间皮瘤YMeso8A和YMeso8D细胞株的建立.pdfVIP

一458一 崔有斌1，张莉1，王凯忠H，张哲1，王凯环2 (1．吉林大学第一临床医院胸外科，吉林长春130吆1；2．黑龙江省海林市海林镇医院) 恶性胸膜间皮瘤是一种起源于浆膜腔的间皮细 P53，Nn[123基因特异PCR引物： 胞的少见的高侵袭性的恶性肿瘤。由于缺乏很好的 P：53基因： 人恶性胸膜间皮瘤细胞的体外模型，对于其临床治 疗及药理学疗效分析等研究就不能顺利开展，影响 Anti sense引物：5’ctga移agc萨搬吨ggt3’ 了对疾病的治疗研究。我们从恶性胸膜间皮瘤病人 Exon6： 的胸腔积液中培养建立了两株恶性胸膜问皮瘤的细 胞株Y-Mes08A，Y．Mes08D，并对其生物学特性进行脚：sen∞ 引物：5’孵tctgac弛aclcacca3’ 分析。 蜥锨lse引物：5’孵龇ca陡；tg{删’ 1材料和方法 1．1材料胸水来源于日本名古屋大学医学部胸 胁iSeIlse引物：5’勰c比ccctttc呼’ 部外科一位患者。采用常规胸腔穿刺方法采集，放 N玎也3基因： 入无菌容器以冰盒保存后，速送细胞培养室。 1．2细胞株建立及观察胸水离心后，计数活细 胞，接种于砒)MI．1640培养液3d后，用PBS冲洗回 sSCP法进行序列分析： 收后继续培养，三天更换培养液。至第25d在显微 凝胶制备后，取pCR产物用甲酰胺染色液，95 镜下观察到细胞增殖活跃时，开始传代，共传代60 ℃变性后电泳，放射自显影。用照片对照正常组，检 次。超低温保存。 定异常片段后取出之，加入PCR试验管内，加温、使 分别用Gi瞰嫩和瑞氏结晶紫染色，用荧光显微 DNA从凝胶中析出。提纯DNA并进行序列分析。 镜观察细胞形态。 2结果 将对数生长期的细胞用胰酶消化制备细胞悬 2．1所建细胞株形态学观察将培养细胞放在载 液、培养，计数活细胞，共计7d，计算分裂指数并计 物台上，用倒置显微镜观察，先用低倍后用高倍镜观 算细胞倍增时间。 、 察细胞形态，并记录，可见贴壁生长细胞呈短梭形、 1．3细胞株染色体分析采用GieII]吼显带法制备 类多边形和不规则形等多种形态，有多个胞质突起， 染色体：培养方法同上，终止培养前1．5h，用秋水仙 培养细胞在整个传代周期中始终不能开成致密单 素的营养液，使细胞生长停止在中期。后置于温箱 层，重叠性生长较为明显。细胞贴壁能力差，经震荡 25 miIl，胰酶消化，Gi锄sa染色，冲洗晾干后封入树 或吸管吹打即可脱落形成分散的细胞悬液，细胞核 胶，常规染色体观察记录。 质比例较大，核大小相差悬殊，偶见巨核。核呈圆 1．4裸鼠异种移植瘤模型的建立如上制备细胞 形、卵圆形和不规则形。核仁突出，有的多达4～5 悬液，调成l×107个／甜浓度，接种于裸鼠皮下(O．2 个。见图1。 ml，支)，相当于每个部位2×1驴个细胞。每日检查，2．2细胞增殖速度的测定经连续7d的细胞计 1个月处死动物，解剖肿瘤，福尔马林固定，石蜡包 数，以培养天数为横坐标，以每天细胞数为纵坐标， 埋，切片，脏染色，镜检。 在半对数坐标纸上绘制生长曲线，再计算出细胞倍 1．5所建立细胞株的相关癌基因的变异分析采 增时间如表l所示，结果表明：经苔盘蓝染色，活细 用PCR-SsC