质粒不稳定性.pptVIP

酶切后仅得到一条长度均为6.6kb的线性质粒条带, 是重组质粒pETNHM长度的理论值, 说明酶切前的样品为pETNHM的二聚体。就是说,重组质粒pETNHM在宿主L21(DE3)中, 主要以单体和二聚体2种形式同时存在, 且由Total Lab软件的定量分析可知,这2种形式的质粒比为12。由于质粒的寡聚化效应会降低重组质粒的拷贝数,故而大量形 成的重组质粒pETNHM的二聚体不利于质粒的分离稳定性。 连续传代及诱导产酶对质粒pETNHM的拷贝数的影响 质粒 pETNHM属于松弛型,应该具有较高的拷贝数。分别取2.4ml在LB培养基中传10代、30代以及经过诱导产酶的BL21(DE3)/pETNHM菌液(细胞计数结果分别为2.16×109个/ml 、1.92×109个 / ml及1.87×109个/ml),小心提取质粒,分别获得1 00μl质粒样品。各加样3μl进行0.7%琼脂糖凝胶电泳, 同时加入3μl(150ng)DNA Marker作参照 。采用Total Lab软件计算可知, 3 条泳道中质粒的质量分别为77.6,46.2和21.8ng。则3种菌液收获的质粒的理论产量分别为 0.92μg /ml、0.55μg/ml和0.26μg/ml。 因pETNHM单体的分子大小为6600bp,每单位碱基对的平均质量为1.059×10-15μg,因 此pETNHM单体的分子质量为:6.989×10-12μg(即4.21×103kDa )。计算表明, 3种菌液中重组质粒pETNHM的拷贝数(以单体计)分别为61、41和20。 该结果说明, 在不同的传代培养和诱导表达条件下, 重组质粒pETNHM在宿主细胞中的拷贝数差异很大。首先, 长时间的传代培养会使质粒的复制能力有所降低,从而使拷贝 数减少。其次, 菌体经诱导产酶后, 由于蛋白表达过程需要占用较多的能量、营养和前体物质, 所以也会导致质粒拷贝数的下降, 从而影响质粒的分离稳定性。此外, 由于以二聚体形式存在的重组质粒在宿主细胞中约占总量的2/3 , 而二聚体质粒的拷贝数仅为单体质粒拷贝数的1/2,因此,质粒的二聚化现象也必然会影响到质粒载体的分离稳定性。 质粒引入对宿主细胞生长的影响 理论上讲,质粒pETNHM在E.coliBL21(DE3) 中的引入, 将对宿主细胞的生长造成一定的 生理负担, 从而影响质 粒的分离稳定性。将 重组菌E.coli BL21(DE3)/p ETNHM和宿主菌 E. coli BL 21(DE3)在LB培养基中进行平行培养, 测定OD600值随时间的变化曲线, 并计算其比生长速率。 由图可见, 重组菌和宿主菌的最大比生长速率分别为0.732h-1和0.689h-1, 重组菌略高于宿主菌。也就是说,重组菌BL21(DE3)/pETNHM并没有由于携带质粒而表现出严重的生理负担。重组菌和宿主菌的这一生长特性将有利于避免质粒丢失后的空宿主细胞发展成为优势菌群,从而有利于保持质粒的分离稳定性。 综上所 述, 在高产腈水合酶的重组大肠杆菌 E.col i BL21(DE3) /pETNHM中, 重组质粒pETNHM具有结构稳定性和分离不稳定性。其中,质粒载体的二聚化效应、重组细胞的 连续分裂以及腈水合酶的诱导表达等因素都将加重质粒的分离不稳定性。反之,重组细胞相对于宿主细胞的较高比生长速率有利于保持有质粒细胞的生长优势, 而抗生素的正向选择压力则将保证重组质粒在重组细胞内的稳定遗传。 质粒载体的不稳定性分析 质粒载体不稳定的现象 克隆有外源基因的质粒载体转移到大肠杆菌受体细胞之后，会产生一系列的生理效应，影响到自身的稳定性、 可能引起形态学上的变化：丝状现象和脆性增加。 产生无质粒的突变体或拷贝数低的突变体。 结构重排导致无法正常表达的突变体。 质粒载体不稳定性的类型 分离不稳定性 指在细胞分裂的过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增殖为无质粒的优势群体 机构不稳定性 由转位作用和重组作用所引起的质粒DNA的重排和丢失。 结构不稳定性 原因：DNA的丢失，插入和重排。人工构建的多个串联启动子的质粒载体容易发生丢失作用。寄主染色体及质粒载体的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的不稳定性。 共同特征：同向重复序列之间的同源重组（short direct repeat). 例如：用含有酪氨酸操纵子的多拷贝质粒载体转换大肠杆菌tryR菌株时，由于IS1因子的插入效应，结果产生出具有插入或者缺失的修饰型的质粒载体。 分离的不稳定性 原因：细胞分裂过程中的质粒的不平均分配。 由于缺陷性分配（defective partitioning）所造成的质粒的丢失现象叫做质粒分离的不稳定性。 质粒稳定遗传的两个必要条件：一、平均每个时