肿瘤学常用实验技术考题整理.docVIP

1、组织培养中常见污染的种类和途径 凡混入培养环境中对细胞生长有害的成分或造成细胞不纯的异物 微生物：细菌、真菌、病毒、支原体； 细胞以及化学物； 途径：空气；操作过程；血清；组织本身；清洗消毒不彻底 2. 在DNA重组中常用的工具酶及如何在DNA重组中应用它们？ （1）限制性内切酶：识别特异序列，切割DNA （2）DNA连接酶：催化DNA中相邻的5′磷酸基与3′羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合，连接DNA片段 （3）DNA聚合酶Ⅰ：a.合成双链cDNA中第二条链； 　　 b.缺口平移制做探针； c.DNA序列分析； d.填补3′末端； （4）Taq酶 催化PCR反应，聚合DNA。 （5）反转录酶 a.合成cDNA； b.替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析； （6）多聚核苷酸激酶 催化DNA 5′羟基末端磷酸化，或标记探针； （7）碱性磷酸酶 切除DNA5′末端磷酸基； （8）末端转移酶 在3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾； （9）DNA酶：切割DNA； （10）RNA酶：切割RNA； 3. 双向电泳的定义及基本步骤 双向电泳是等电聚焦电泳和SDS的组合，即先进行水平方向的等电聚焦电泳，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；再进行垂直方向的SDS，使蛋白质按分子量大小得到分离，经染色得到二维分布的蛋白质图。 基本步骤：（1）样品制备：目标是尽可能扩大蛋白样品的溶解度和解聚。 细胞样品：直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白； 组织样品：液氮中研碎组织，用三氯乙酸－丙酮沉淀蛋白，再用裂解液复溶； 体液样品：去除高丰度蛋白，三氯乙酸－丙酮沉淀蛋白，再用裂解液复溶； （2）Brandford法蛋白定量：考马斯亮蓝G-250 在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值，且595nm的光吸收值与蛋白的含量成正比。 （3）第一向等电聚焦电泳：pH梯度的选择要先宽后窄，先短后长，先线性后非线性； （4）平衡：使被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS顺利进行。 （5）SDS （6）考马斯亮蓝染色或银染； （7）图像采集和分析。 4.在流式细胞实验中，设置阴性对照、同型对照、荧光补偿对照的作用及如何设置? 同型对照：由于抗体与细胞间存在非特异性结合（电荷间互吸等），流式抗体与细胞结合时有特异性结合和非特异性结合，同型对照用于消除非特异结合所至非特异染色。如荧光素FITC标记兔抗人CD34抗体IgG的同型对照应该是荧光素FITC标记兔抗人IgG。 阴性对照：用于消除实验细胞本身的自发荧光，可将上述的同型对照作为阴性对照。 荧光补偿对照：荧光补偿是指修正荧光光学信号在探测器之间相互渗漏并被数字化检测的过程。 荧光补偿对照：在双色系统中选用原样本进行一种荧光素的单染，用于检测荧光补偿调节是否正确。 5. 运用流式细胞技术如何从一种组织或细胞系中寻找肿瘤干细胞. SP细胞：SP细胞被认为是肿瘤干细胞，其特征是能将细胞染液Hoechst泵出细胞； ALDH法：增殖能力高的细胞，醛脱氢酶高； 肿瘤干细胞表面有特殊的肿瘤标志物如CD133； 6. 抗原修复的方法及非特异性染色的消除方法 真空负压抗原修复法；微波辐射抗原修复法；高压抗原修复法；蛋白酶消化法。 非特异性染色的消除：a、透析，荧光素可以通过半透膜，而蛋白质分子不能透过，可将位于蛋白结合的荧光素透析出去； b、葡聚糖凝胶G-50柱层析法，分离荧光抗体试剂中游离荧光素； c、DEAE纤维素柱层析法，除去标记过多或过少荧光素的抗体分子； d、荧光抗体稀释法，减少非特异性结合，增加特异性结合； e、纯化抗原法，用各种方法提纯单一成分的抗原以制备单价特异性抗体； 7、免疫组化的优点 免疫组化利用抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原，并对其进行定位、定性及定量的研究。其优点有：特异性强，敏感性高，定位准确，形态与功能相结合。 8、实验动物和动物实验的概念，常用实验动物的分级及屏障环境所需控制的基本条件 实验动物：经人工培育，对其携带的微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清除的，用于科学研究、教学、生产以及其他学科实验的动物。 动物实验：在实验室内，为了获得有关生物学、医学和其他学科新的知识或解决具体问题而使用动物进行科学研究的行为。 常用实验动物分为普