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ENU对草鱼精子的诱变及在 F1代中的突变效率 邹曙明 蒋霞云 孙成飞 郭秀明 程洛单 (上海海洋大学农业部种质资源与利用重点开放实验室，上海201306) 摘要：ENU诱变是近年来发展起来的获得模式生物功能突变体的新手段，在养 殖鱼类的遗传改良方面也具有潜在的发展前景。研究显示，以0～10mmol等不 同浓度的ENU溶液处理草鱼精子45min，与野生型雌鱼受精产生的胚胎在体节 期的畸形率分别为3．1％一91．3％，胚胎畸形率与ENU浓度成正比；正常鱼苗的 出苗率分别为93．1％～4．4％，与ENU浓度成反比。最后选用1mmol浓度ENU 溶液处理精子，受精后产生的子代的正常率大约为50％，这些子代在1龄阶段生 长差异极大，产生了一定比例发育正常、快速生长的个体；提取15尾1+龄诱变 F1子代的基因组DNA，对6个生长发育通路相关基因万一2a、万一2b、mstrt一 1、mstrt一2、．恕一1和必￡一2的部分阅读框进行基因组DNA的PCR扩增、克隆和 测序，结果显示，ENU主要诱变基因组DNA产生GC到AT或AT到GC的点突 变，可造成密码子的无义突变、错义突变和同义突变，ENU对上述6个基因的平 均诱变率为0．41％。这些结果表明，ENU溶液浸泡精子可在草鱼中实现高效诱 变，在将来的功能基因组研究和诱变育种领域具有潜在的应用前景。 关键词：草鱼；ENU诱变；诱变F1代；突变效率 迄今为止，鱼类等生物的遗传育种主要是发现突变体，并通过选育和杂交的方法获得 良种。截至2010年，我国已选育出73个水产改良新品种，其中包括选育品种39个和杂 交种34个¨。31。这些水产良种的育成，从本质而言，均是利用自然界已存在的携带优良 性状基因的突变体，在此基础上加以选择、固定，从而建立优良品系，因此，优良性状突 变体的获得是实现育种目标的关键H“j。然而，鱼类基因自发突变的频率相对较低，通常 低于10～，需要很长时间和在大群体中进行筛选，难以获得突变体，导致养殖鱼类育种周 期较为漫长073。 养殖鱼类繁殖力强、体外受精和体外孵化等特点都十分有利于实施基因组化学诱 通过对基因组DNA碱基的烷基化修饰，诱导DNA在复制时发生错配而产生突变n0’11]。它 2 2011年中国水产学会学术年会论文选集 主要诱发单碱基突变，从而使得相应基因发生突变，其诱变模式与自发基因突变特征类 似。同时，ENU的突变效率非常高，单个位点的突变率可达0．5×10～～3．9×10～，是其 他突变手段的10倍左右，而且这种突变是随机的，不具有任何的倾向性¨2’”1。目前， ENU诱变已在果蝇、斑马鱼、青鲔、非洲爪蟾和小鼠等模式生物中成功开展，获得了一些 列功能突变体，成为解释模式生物功能基因组的重要方法和手段114。16I。尽管，化学诱变 技术已广泛用于微生物和作物的遗传育种，但国内外在养殖鱼类中开展的极其有限。17’181。 草鱼(Cetpharyngodon 类，是我国淡水养殖的“四大家鱼”之一，2008年，我国草鱼总产量已达400万t¨引。草鱼 性成熟时间通常需要5年以上，体重在大于lOkg，迄今为止，草鱼难以获得选育良 种心0。24|。本研究通过探索ENU浸泡草鱼精子的方法诱发精子DNA突变，并通过对诱变 Fl后代的发育观察和6个生长相关基因突变位点的检测，证实该方法可有效诱变草鱼基 因组。由于草鱼常规选育周期较长，本研究可为进一步的草鱼生长性良种培育和功能基因 的解释积累资料。 1材料和方法 1．1 ENU工作液的配制 参照金鹏等方法¨4|，将0．1g mL浓度为10mmol的 ENU(Sigma公司)溶解于8．5 NaOAc溶液中，配成0．1mo!的ENU母液；使用前，用改进的Hanks平衡盐溶液稀释到 0．5mmol、1mmol、5mmol和10mmol等不同浓度的ENU工作液。改进的Hanks溶液的配 制方法：0．4 KCl、8NaCl、0．35 0、0．1 g g g NaHC03、0．09gNaH2P04·7H2 g MgS04·7H20、0．1gM