β-TCP%2fBMSCs组织工程骨细胞含量在兔脊柱后外侧融合中作用的研究.pdfVIP

第四届中华骨科杂志论坛天津·2012 B-TCP／BMSCs组织工程骨细胞含量在兔脊柱后外侧融合中的作用研究 第四军医大学西京骨科研究所陕西西安710032 陈永锋雷伟张扬冯亚非石磊刘宁王林裴国献 目前，取自体髂骨植骨仍被视为脊柱后外侧融合的“金标准”，但自体骨量不足，且存在取骨区并发 症。而异体骨、异种骨的成骨能力有限，存在免疫排斥和疾病传播的风险。近年来，贝奥路(Biolu)、 作为植骨材料在脊柱后外侧融合手术中的应用逐渐增多，由于仅有骨传导作用，且一TCP融合效果有限，融 合率较低。 marrowstem 研究表明体外培养的骨髓基质干细胞(Bone 原因之一是BMSCs接种数量有限，培养时间过长，无法满足临床用量需求。因此，本实验以B-TCP为支架， 体外构建复合有不同数量BMSCs的组织工程骨并用于新西兰大白兔脊柱后外侧融合，观察支架上承载细胞 数量对融合效果的影响，探讨用于脊柱后外侧融合的B—TCP／BMscs组织工程骨上适宜的复合细胞数量和密 度，为临床型B—TCP／BMSCs组织工程骨的构建和应用提供实验参考和依据。 材料和方法 一、主要试剂及材料 Prober (1，l’-dioctadecyl-3，3，3’，3’tetramethylindocarbocyanineperchlorate，Dil)购自美国Molecular u II 多孔结构，球形孔径100-400m，孔间连接径100--150m，孔沟通率99％。支架经称量后均分为Ig／份(体 积约1．5cc)，独立包装，并经高温高压消毒。 二、B骼Cs的分离和培养 无菌条件下取5天龄新西兰大白兔(第四军医大学实验动物中心提供)仔兔双侧股骨，剪除干骺端， II p 完全培养基(含i0％胎牛血清、100g／ml青霉素、100 3天后第一次换液，以后隔天换液。当原代细胞融合成单层(底面8096)后，按1：3传代培养。 三、删SCs复合B-TCP 细胞培养2周后更换加入lO-8mol／L地塞米松、lOmmol／LB一甘油磷酸钠和0．25mm01／mL抗坏血酸诱 中分别培养Id、3d、7d，隔日换液。 四、动物手术 ld、3d、7d 消毒铺巾。沿背部正中切开皮肤约7cm，逐层分离皮肤、皮下，显露棘突，沿棘突分离双侧椎旁肌至小关 节突外侧，显露L4-L5棘突、椎板、小关节突。切除双侧小关节囊及关节软骨，以磨钻去除棘突基部、关 材检测。 五、检测指标 1．MTT检测 ．．353- 第四届中华骨科杂志论坛天津·2012 i／孔，37。C孵育4h，吸弃孔内液体后再加入DMS0500uI／孔，振荡至蓝紫色结晶物 5mg／ml的MTTi00|l WelIscan u Dragon 完全溶解。按100I／孔加入96孔板，每样本5孔。用酶联免疫检测仪(Labsystems 平均细胞活力。 2．扫描电镜观察 于SEM(HITACHIS-3400N，日本)下观察细胞形态及分布情况。 3．Dil荧光染色 将Dil荧光染料加入5X 荧光显微镜及Viewfinder图像采集软件观察细胞形态及分布情况。 4．X线检测 术后12周处死动物前拍摄X线片，观察新生骨生成及脊柱融合情况；参照Lane—SandhuX线评分标 准进行评分及定量分析，比较各组成骨情况及融合效果。 5．大体观察及融合率测定 取材后，去除椎体周围及植入材料部位的肌肉及软组织，观察植入材料区域有无融合成片，满足以下 标准任意2