一株犬种布鲁氏菌的分离和鉴定.pdfVIP

第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集(2012年) 一株犬种布鲁氏菌的分离与鉴定 周桂兰1，李旭妮2，程君生2，王楠2，丁家波2，毛开荣2+韦海涛1，薛水玲1，祝俊杰 00081) (1．北京市畜牧兽医总站，北京100107；2．中国兽医药品监察所，北京1 摘要：本研究对从一只流产贵宾犬全血中分离到的一株布鲁氏菌进行了形态结构、培养特性、生化特性研究以及凝集试 验鉴定和AMOS—PCR鉴定。研究表明，分离菌为革兰氏阴性菌，在胰际琼脂培养基布鲁氏菌生长并呈典型的粗糙型布鲁氏菌菌 落，菌落能被结晶紫溶液染成紫色。分离菌在琉瑾和复红培养基上生长，不产生H：s，与粗糙型布鲁氏菌阳性血清凝集，与光 滑型布鲁氏菌阳性血清无凝集。用AMOS-PCR方法对分离菌进行鉴定，该分离菌具有犬种布鲁氏菌特有条带。鉴定结果表明分 SGBl。 离菌符合犬种布鲁氏菌特性，将其命名为B．cani 关键词：布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌、AMOS-PCR、细菌鉴定、凝集试验 犬种布鲁氏菌是布鲁氏菌属的一个生物种型，与牛种、羊种、猪种布鲁氏菌一起，引发犬的布鲁氏菌 病(布病)。患病母犬的主要临床症状是流产，生产弱仔，产道炎；患病公犬临床多表现为其交配母犬可发 生流产，精液中可携带布鲁氏菌和大量炎症细胞及病变精子，部分病犬出现附睾炎和睾丸萎缩等炎症病变。 2012年2月，从一居民家养贵宾犬的前肢静脉血中培养分离到疑似布鲁氏菌，经过血清学试验、生化试验、 canis PCR试验鉴定确定该菌种是犬种布鲁氏菌，将该菌株命名为BrucellaGBl。此病原携带犬的品种是 贵宾成年犬，第一次发情与自家公狗交配，顺利产下4只健康幼犬，第二次发情与他人养的一只贵宾犬交 配，怀孕51天后发生流产。该病犬流产后的第115天体表温度达38．9。C，眼睛有大量脓性分泌物对其前肢 静脉采血，从全血中分离得到该菌。 1 材料 1．1 试验血样无菌采血自北京一居民家养流产贵宾犬，分离血清保存于一20℃。 1．2菌株对照用菌株牛种布鲁氏菌A19(CVCC70202)、羊种布鲁氏菌M28(CVCC70003)、犬种布鲁 氏菌RM6／66(CVCC70701)、猪种布鲁氏菌s2(CVCC70502)均来自中国兽医药品监察所。 清与阴性血清来自中国兽医药品监察所。 产品。 1．5试剂PH8．9Menzel’S缓冲液(蒸馏水1000ml；NaC030．7959；NaHC037．149；NaCl59；苯酚59)、 石炭酸生理盐水、布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原、布鲁氏菌病试管凝集试验抗原来自中国兽医药品监 Marker DR001B)、DNADL2000(Lot：D501A)均购自TAI(ARA公司。 2方法 2．1 细菌的分离、培养特性和生化试验 2．1．1 细菌培养试验犬采血后立即全血接种胰际琼脂斜面培养基，37。C培养72小时。 2．1．2菌体、菌落染色将菌体涂抹于玻璃片上，火焰固定后革兰氏染色，油镜观察。用布鲁氏菌菌落结 晶紫染色液对菌落染色15秒后观察。 2．1．3生化试验将醋酸铅滤纸条放入增殖的待检菌样品中，37。C培养72小时，观察结果。 2．2凝集试验 基金项目：北京市农业局科技项目；公益性行业(农业)科研专项经费项目(200903027) 作者简介：周桂兰 ’通讯作者：毛开荣，1958，男，研究员，主要从事预防兽医学研究。E—mail：maokairong@ivdcgov．cn 虎红平板凝集试验抗原30微升混合反应，5分钟后观察结果，出现凝集颗粒，液体完全透明记为++++；有 明显的凝集颗粒，液体几乎完全透明记为什+；有较明显的凝集颗粒，液体稍透明记为++；稍能见到凝集， 液体混浊记为+；无凝集，液体均匀混浊记为一。 2．2．2试管凝集试验 2．2．2．1 几乎完全凝集和沉淀，液体75％清亮记为+++；有显著的凝集和沉淀，液体50％清亮记为++；有清楚的凝集 和沉淀，液体25％清亮记为+：无凝集和沉淀，液体均匀混浊记为一。 性对照血清用PH8．9Menzel’S缓冲液作1：12．5、1：25、1：50、1：100倍稀释。 小时，取出与比浊对照管比较读取结果。 2．3