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数字PCR 在个性化医疗相关分子生物标志物 开发及分析中的应用 摘要: 在未来十年内，医学保健的目标是提供优质高效的个性化医疗。PCR 方法 会在实现这个目标的过程中发挥重要作用。相比于传统的PCR ，数字PCR 技术 有着无可比拟的优势。在文章中，着重回顾了数字PCR 技术的发展，突出其优 势并集中讨论其在分子生物标志物开发和分析中的应用，尤其是个性化的生物标 记物。同时，还对数字PCR 产业的发展，例如如何将数字PCR 与二代测序(NGS) 整合在一起助力个性化医疗进行延伸讨论。 数字PCR 的特征 1. 稀有变异检测（Rare variant detection ） 从外周血内获得分子生物标记物、进行特异突变筛查、监测病程是医疗保健的一个发展 方向。这要求检测体系(探针和引物)必须保证能在高背景野生型等位基因存在的条件下检测 到低丰度的突变基因。由于数字PCR 降低了对反应扩增效率的要求，采取终点法判读的方 法，数字PCR 可以很好的胜任稀有变异检测的工作，同时也减少了引物设计过程中由于扩 增效率不合要求而造成的浪费(时间、样品、耗材等等)。 2. 拷贝数变异（Copy-number variation ） 虽然生殖系或体细胞拷贝数变化是否具有临床意义需要取决于具体临床情况，但 CNV 改变基因表达水平却有十分重要的临床意义。数字PCR 具有准确性和精确性的特点，这使 得其可以在CNV 研究中发挥重要的作用。在有已知拷贝数的内参基因的前提下，数字PCR 不但可以清晰区分一个或者两个拷贝，更可以对多拷贝基因进行分析，例如，五个或者六个 拷贝。在这一点上，相比于包括qPCR 在内的常规方法，数字PCR 优势明显。 3 样本需求量低（Minimal template requirements ） 数字PCR 的一个主要优势是所需样本量很低，这对于一些临床样本来说特别重要，尤 其是样本珍贵或者样本核酸存在降解的情况下。目前很多基因组研究方法，例如CGH 芯片、 二代测序等，在实验之前都需要对有限的临床样本进行扩增以保证达到实验样本量的要求。 然而，实际情况是，预扩增会引入偏向（bias ），无法保证不改变样本内待测基因的相对丰 度，对实验结果影响的严重程度取决于不同的应用。 数字PCR 样本需求量低的特性可以避免由于预扩增所引入的实验误差，更好的实现实 验的精准性和可靠性。 4 分析便捷（Ease of Analysis ） 数字PCR 有或无的结果判读非常简洁。对于相对定量分析来说，只需使用泊松原理将 阴性/阳性微滴的比例转换成表达丰度、使用一个或多个内参基因进行均一化后即可完成分 析。 5 与二代测序整合（Integration with next generation sequencing protocols ） 如何在临床领域发挥 NGS 的巨大优势是一个重要的问题。数字 PCR 是一项非常有用 的互补型技术。例如：使用数字PCR 检测患者特异性标记物，与肿瘤配对末端测序实验结 果进行相互验证，并且可以进行NGS 文库的制备和定量。 目前很难确认什么样的NGS 结果是临床所需要的，通常来说 NGS 筛选到的变异或异 常还需要使用经典的Sanger 测序进行验证。数字PCR 的出现，可以为NGS 发现的突变进 行有效验证提供一个非常好的实验思路与平台。 数字PCR 在生物标志物检测领域的应用 1. 突变/稀有变异检测（Mutation/rare variant detection ） 随着伊马替尼（imatinib ）在bcr-abl 阳性的慢性粒细胞白血病上的成功应用，越来越多 的科学家将研究重点转移至生物标记物的开发及基于特异基因的靶向治疗。数字PCR 已经 成功的应用于肿瘤组织内的EGFR 检测以及EGFR 突变频率的分析。 是否能够开发出有效的靶向治疗药物，与突变基因的检测密切相关。其中（1 ）携带药 物作用突变位点的癌细胞百分比；（2 ）突变的特定等位基因是否可以被准确检测到，这两 点都直接影响到靶向治疗是否有效。很显然，在肿瘤均质细胞内检测单一突变相对简单，但 是如果在异质组织内，在仅存有少量突变存在的情况下，如何准确检测出突变/稀有变异， 或者针对于同一种癌症中多种亚克隆的准确鉴定，对个性化医疗的发展是一个巨大的挑战。 最近的一项研究表明，数字PCR 在进行突