家兔γ-干扰素在昆虫细胞中表达及其活性测定.pdfVIP

酱、生肉和火腿等食物样品进行病原微生物的检测，建立了一套行之有效的病原微生物检测 方法。 张奇(1979～)博士，1998年9月至2002年7月就读于南开大学生命科学学院微生物 学系，2002年9月考入南开大学微生物学系攻读研究生，2007年6月获得理学博士学位后 留校任教，主要从事药学、免疫学及分子生物学等研究。主持或参加包括“973”、国家科技 重大专项、国家“十五”攻关项目、国家自然科学基金、天津市科技支撑计划、天津市自然 科学基金等在内的多个自然科学基金项目，主要开展肿瘤糖蛋白相关研究和病原微生物的检 测技术开发：同时进行中药有效成分、微生物代谢产物药物及肽类药物的开发工作。共发表 国内外学术论文25篇，申请专利4项，参编教材2部。 家兔Y一干扰素在昆虫细胞中的表达及其活性测定 王芳1，胡波1，任雪枫2，范志宇1，张则斌1，徐为中1，何孔旺1 I．江苏省农业科学院兽医研究所·农业部动物疲病免疫与诊断重点开放实验室·国家兽用生物制品工程技 术研究中心，南京210014 2．江苏省动物疫病预防拉制中心，南京210036 干扰素(Interferon，IFN)是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等活性的细胞因 子。目前，猪、犬、鸡等多种动物的IFN—Y基因被成功克隆并表达。与人类和其他哺乳动物 相比，兔IFN—Y的研究比较滞后，在我国近年仅有极少数有关家兔的IFN—Y基因的研究报道。 99．4％(图4)；然后通过克隆、转化将家兔Y一干扰素基因转入转移载体pFastBac疆l，得 重组IFN—Y在Sf9昆虫细胞中得到表达。用兔IFN-YELISA试剂盒中标准品稀释液将重组 同时将标准品(1000 做标准品的标准曲线，依据标准曲线和样品曲线，测定重组兔IFN—Y的浓度为1950pg／mL。 重组兔IFN—Y抗病毒活性测定采用犬肾细胞MDCK-VSV(水泡性口炎病毒)系统微量细胞病 变抑制法。多次重复活性试验表明，重组兔IFN—Y在MDCK上显示了较高的抗病毒活性，能 有效地抑制VSV对细胞的破坏作用。将抑制50％VSV产生的细胞病变(CPEm)的干扰素的最 高稀释度定为1个干扰素单位，测得重组兔IFN—Y的活性约为5．12×105U／mg。 本研究用杆状病毒表达系统对兔IFN-Y进行了表达。研究发现，杆状病毒作为基因表达 载体，具有表达产物具有活性的优点。昆虫细胞对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物 细胞接近，能识别并正确地进行信号肽的切除及磷酸化、糖基化等反应，表达产物具有很高 的生物活性，其抗原性、免疫』《i性均与大然蛋白相似。因此．本研究表达的兔T阱Y与原核 表达系统表达的【FK—Y相比，可能更接近于天然的兔JFN—Y．本研究用兔[FN—vELISA试剂 盘检测晕组IFN—Y及其浓度也旺实了这一点．因为兔[FN—rELISA试剂盒是用下检测免血清 中IFN—y的，我们用它粜检测表达的兔TFNY，结果也出现了阳性反应，说明用此系统表选 兔IFNY更接近下天然。另外，杆状病毒只感染非脊椎动物．对家免等畜禽及人类都l_分安 全，因此有利于重组兔IFNY的相关研究和临床应用。 本文首次克隆了新pH兰白兔[FN—Y全基因．并成功构建，免[FNY重组杆状病毒．实现 rIFN—Y在昆虫细胞的高教表达．为重组免IFN—Y的研究、生产及其在养兔业中的应用奠定 r基础。 图1兔IFNY基因的扩增结果 FigI ofrabbitIFN—y Amplification gene I DNAMarkerfDL-2 000)； I。 2 RT-PCR 门 products TTTCGAGGTCGGcGAGc^TCCAAGTACTGA 图2兔IFN—v基因cDNA测序结果