血管紧张素转化酶活性抑制剂──丝素肽的分离、纯化与结构鉴定.pdfVIP

血管紧张素转化酶活性抑制剂— 丝素肽的分离、纯化和结构鉴定 倪 莉1，陶冠军2，戴 军2，王 璋2，许时婴2 1（.福州大学生物工程研究所，福建福州350002;2＿无锡轻工大学食品学院，江苏无锡214036） 摘要：可溶性丝素粉末经碱性蛋白酶Alcalase水解后，其酶解产物对血管紧张素转化酶(ACE）的活性有很强的抑制 作用。采用凝胶过滤色谱脚padexG-15和反相高效液相色谱R（P-HPLC）对水解度为20％的酶解产物进行分离纯 化，利用质谱鉴定其中一种ACE抑制荆是肽，其结构为Gly-Tyr。 关键词：反相高效液相色谱法；质谱；丝素肽；血管紧张素转化酶；活性；抑制剂 中图分类号：658 文献标识码：何 文章编号:1000-8713(2001)03-0222-04 溶液；洗脱液流速：20mL/h；检测仪：8802型紫外检 1 前言 测仪 温（州孚华分析仪器厂）；记录仪：XWD1-100记 血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂可作为降血压 录仪上（海自动化仪表三厂）；检测波长：220nm。 的药物，目前已有许多种ACE抑制剂类合成药物。 2.2.3 RP-HPLC分离纯化丝素肽 HPLC系统： 然而因这类降压药物属酶的竞争性抑制剂，它们对 WatersT650EAdvancedProteinPurificationSystem 酶活性部位的抑制是可逆的，药物作用时间不长，停 美（国Wats公司）；色谱柱 μ藼ondapaj C8P/N 药后会使血压反弹；而且，这类药物被吸收和排泄的 84176(7.8m i.d.×300mm)美（国Waters公 速度较快，经肾脏排出易损害肾功能，有一定的副作 司；）检测器:DualλAbsorbanceDetector,210mn 和 用，因此，亟 寻找安全、长效、无毒副作用的新型降 280nm；进样量：20Q蘈μL～400μ蘈；洗脱液流速：3 压药。最近，从明胶、酪蛋白、玉米和大豆等食品中 mL/min;洗脱条件：0min～10min100%A,10min 成功地分离出具ACE活性抑制作用的降压肽[1～4]， ～20min0%B～?0%B,20min～30min50%B,30 它们具有无副作用、安全性高等优点，备受人们的关 min～?35min50%B～?0%B,35min～38min100% 注。 A(A液：水；B液：体积分数为30％的乙腈水溶液）。 本研究以可溶性丝素粉末为原料[5]，直接采用 2.2.4 氨基酸组成分析 采用835-50氨基酸自动 碱性蛋白酶Alcalase进行水解，制备ACE活性抑制 分析仪日本Hitachi公司）分析氨基酸的组成。 剂— 丝素肽。采用凝胶过滤色谱SephadexG-15 2.2.5 质谱鉴定 质谱仪：PlatformLCZ-4000美（ 和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对丝素酶解产物 国Waters公司）；毛细管处电压：3.50kV;离子化温 进行分离纯化，并用质谱仪对其功能因子进行结构 度：120℃；脱溶剂温度：200℃；检测的相对分子质 鉴定，从而为新型降血压药物的研制提供了新途径。 量范围：100～?900。 2 实验材料和方法 3．结果与讨论 2.1 材料 3.1采用，phadexG15分离纯化丝索肽 可溶性丝素粉末[5]（自制）,Alcalase(2.4L)丹（ 丝素经碱性蛋白酶Alcaase水解后，水解度为 麦Novo公司）,ACE和马尿酰组氨酰亮氨酸(hip- 20％的酶解产物(简称样品A20)对ACE具有最强 purl-L-His-L-Leu)美（国Sigma公司），甲醇和乙腈 的抑制作用[6]。比较多种洗脱液对样品A20的分 为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 离效果[7]，结果表明采用0.01mol/L的HCI洗脱液 2.2实验方法及条件 的分离效果最佳(见图1),洗脱出来的各组分用碱 2.2.1ACE抑制活性的测定