常见单磷酸核苷酸的高效液相色谱分离和测定方法研究.pdfVIP

LC一056 常见单磷酸核苷酸的高效液相色谱分离与测定方法的研究 张书胜‘刘红霞刘振忠吴养杰 袁倬斌 (郑州大学分析测试中心化学系郑州450052) i00039) (中国科学技术大学研究生院北京 1前言 核苷酸是一类在代谢上极为重要的生化物质，它几乎参与细胞的所有生化过程”。’， 因此分析化学家对核苷酸的分离、鉴别、测定产生了极大的兴趣。在现有的分析核苷酸的 光谱法“”、质谱法“、色谱法”1、电泳法“”中，毛细管电泳和高效液相色谱法的分离能 力最强。棉宝是对蚯蚓粪便进行有效成分提取后。经复配加工而成的一种植物抗病剂，它 具有防病、治病、杀菌、营养、调节、促长等多种功能，5’．鸟苷单磷酸(m廿)、5’-尿苷 单磷酸(UMP)、5’一腺苷单磷酸(AMP)、5’一胞苷单磷酸(CMP)是其主要有效成分之一． 因此研究建立棉宝中A咖P．ch伊，Gh但。uMP的测定方法对稳定产品质量具有重要的 实际意义。本文结合自己实验室的条件并参考前人的工作，建立了棉宝中常见单磷酸核苷 酸的高效液相色谱分离与测定方法，应用该方法对其热和冷稳定性进行了研究，结果令人 。满意。 2实验部分 2．1主要仪器与试剂 (250mm×4．6mm i．d．，5蛐A，中国科学院大连化学物理研究所)。Ah但，CM口，GMP。 uMP标准储备液分别用去离子水配制。 2．2棉宝的HPLc分析溶液、热贮和冷处理方法 将棉宝样品用水稀释20倍，以3 000r／min的速度离心5miIl后，取10uL上清液进行 }玎，Lc分析；热贮处理：取10mL棉宝于20lnL的安培瓶中，将口熔封后置于恒温箱中， 的温度下搅拌24h。 3结果与讨论 3．T色谱条件 核苷酸的HPLc法分离．可以有离子对反相“和常规反相”液相色谱法等多种模式供 选择，既可采用等度洗脱”1，也可采用梯度洗脱”。我们根据本实验室的条件和棉宝样品 的复杂程度，选择等度常规反相液相色谱模式对棉宝中4种核苷酸进行分离测定。经研究 发现，核苷酸分离测定的主要干扰物为极性较大的水溶性物质，最先流出色谱柱，当流动 相中增加乙腈或甲醇的比例时，尽管4种核苷酸的保留时间减小。但cMP和uMP的峰 逐渐被水溶性杂质峰所掩盖，影响了cMP和唧的测定，因此，流动相尽可能减少乙 ·136— 腈或甲醇的比例。本实验采用O．05mol／L KH2P04为流动相，在1mMnin的流速下，以 oDs(250mm×4．6mm spherisorb i．d．)为分离柱，以260Ilm为检测波长，4种标准核苷酸 15．12min，cMP 可以获得基线分离，保留时间分别为AMP 3盘2min’G^杼6．56min’uMP 4．42min，此时cMP和uMP的峰位于水溶性杂质峰的尾部，未达到基线。这种情况虽然 不影响cMP和UMP的定性，但定量的准确性就受到一定程度的影响。 3．2 4种核苷酸的工作曲线和检测限 取一定体积的4种核苷酸的标准储备液，用水稀释一定倍数，制成质量浓度c从0．5， 1．o，2．0，5．0，10，20，50mg／L的混合标准溶液．采用上述色谱条件，进行HPLc分析。 C卸．8I+1．22× 记录峰面积爿，求得线性回归方程和检测限(cDD)(姗心，m矾．)如下：AMP o=0．51+1．02×1n 1们坼=6，，=o．9976￡DD=0．90)；CMP O产6，n9989上D班司．65)：GMP o=0铊帕9l×10■《嘲闻9972 Eo嗍鲫：u旧o=0拼+0．75×lO■(嗍间舶9l[D咖司加)。 3．3方法的回收率和重复性 采用标准加入法测定回收率．以多次测定结果的相对标准偏差(船D)表示方法的重复