神经生物学动物模型方法.docVIP

神经组织切片的免疫酶组织化学实验技术 一：实验动物及相关处理SD大鼠一只，250g。动物灌注固定及取材处理，3.6%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，左心室插管，右心耳剪开，先用无菌生理盐水冲洗，至流出液体变清（大鼠一般为250ml），然后换4%多聚甲醛（大鼠一般为200ml），先快后慢至动物出现全身抖动为佳，取材整段脊髓及大脑组织，置于4%多聚甲醛中后固定4h，再置于10%→20%→30%蔗糖溶液中脱水，待组织沉底后，即可进行冰冻切片。2.切片：OCT包埋剂包埋后，冰冻切片机上切取20μm厚度的组织切片3-5片，置于0.01M PBS溶液中二：基本原理抗原抗体反应：抗原与相应抗体的特异性结合反应。其既可在体内作为体液免疫应答的效应机制自然发生，也可在体外作为免疫学实验的结果出现。抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区之间的相互作用，是一种分子表面的特异的可逆的弱结合力。本实验以间接法染色，在二抗上有过氧化物酶标记，其具有催化活性高、催化专一性强；产生的信号产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点? ?? ?? ? 免疫球蛋白结构图? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 抗原抗体反应简图反应公式：DAB（二氨基联苯胺）+过氧化氢（H2O2)→棕黄色物质（DAB氧化物）+水（H2O）。（催化剂为辣根过氧化物酶HRP） 三：主要试剂配制：1.? ?? ???1：3.6%水合氯醛溶液：称取3.6g水合氯醛溶于100ml无菌生理盐水2.? ?? ???2：0.1M（mol/L）PB母液配制：29.01g Na2HP04，2.96g NaH2PO4，溶于1000ml 单蒸水3.? ?? ???3：0.01M PBS液配制：0.1M PB母液100ml，Nacl 9g，加单蒸水定容至1000ml4.? ?? ???4：4%多聚甲醛配制：称取40g多聚甲醛粉末在60水浴条件下溶于1000ml的0.1M PB中5.? ?? ???5：10%，20%，30%蔗糖溶液配制：称取10g，20g，30g蔗糖溶于100ml的0.1M PB液中6.? ?? ???6：3%过氧化氢溶液配制：1ml的30%过氧化氢原液溶于0.01M PBS液中，定容至10ml7.? ?? ???7：5%羊血清封闭液配制： TritonX-100（0.3%）30μl，封闭用正常羊血清原液（5%）500μl，加0.01mol/L PBS定容至10ml，震荡混匀，4备用8.? ?? ???8：2%羊血清封闭液配制： TritonX-100（0.3%）：30μl，封闭用正常羊血清原液（2%）：200μl，加0.01mol/L PBS定容至10ml，震荡混匀，4备用9.? ?? ???9：0.01M PBST溶液配制：0.01M PBS溶液中加入0.1%的Tween-20，震荡混匀10.? ? 10：DAB显色液配制：1ml双蒸水中顺序加入DAB试剂盒中的试剂A，试剂B和试剂C各一滴（约50μl），混匀，现用现配。四：实验步骤：免疫组化流程：1：0.01M PBS溶液漂洗3次，每次5min；2：3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶（HRP）室温下，避光孵育30min；3：0.01M PBS溶液漂洗3次，每次5min；4：加5%羊血清溶液，室温下1h或37孵育30min；5：加适量浓度的一抗稀释溶液（NeuN，1:200,2%羊血清稀释），4冰箱，孵育过夜；6：0.01M PBST溶液漂洗5次，每次5min；7：加PV-9000试剂，37孵育30min；8：0.01M PBST溶液漂洗3次，每次5min；9：加PV-9000试剂，37孵育30min；10：0.01M PBST溶液漂洗5次，每次5min；11：DAB显色，室温下5min，单蒸水终止显色；12：梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；13：图像采集，数据分析 /bbs/viewthread.php?tid=32255extra=page%3D1%26amp%3Borderby%3Ddateline%26amp%3Bascdesc%3DDESC