何水林版基因工程第四章 基因工程的主要技术与原理.ppt

第四章 基因工程的主要技术与原理 周毅峰 2013.03 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 CTAB溶液配制好备用，65℃水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质氧化 65℃水浴一个小时 氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液 两次。10000转/分离心20分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉 等体积预冷的异丙醇 ，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次 。 用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3-5mlTE溶解，加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存 1.2、碱裂解法提取质粒DNA 所用的试剂作用 ④ KAc-HAc缓冲液 碱抽提法提取质粒DNA的步骤 材料准备 细胞裂解 核酸分离、纯化 核酸沉淀、溶解 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 1.3 核酸的纯度与浓度鉴定 1、短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。 2、长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。 ②RNA的储存 RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70℃保存。 注意避免Rnase 的污染； 分装，避免反复冻融； 如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin，保存时间可延长。 如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ PCR 实验的不同需求 特 异 性：基因组扩增、RT-PCR 保 真 性：基因筛选、测序、 TA克隆 长片段扩增：构建基因图谱、测序、分子遗传学 扩增效率：复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） PCR试剂盒：复杂模板扩增、大规模基因检测 Ⅱ简并引物设计（degenerate primers) 非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态 假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃ 1min足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 变性温度与时间 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。 退火(复性)温度与时间： 引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 Taq DNA聚合酶的生物学活性：　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。 延伸温度与时间： PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 　　循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 循环次数 ⑦　PCR实验操作过程 PCR产物纯化 PCR产物纯化试剂盒 PCR产物电泳 ⑧　PCR常见问题 正对照有条带，而样品则无 原因： 该Buffer对样品