研究报告：犬细小病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的研制与应用.pdfVIP

⑧ 2003学术年会 犬细小病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的研制与应用 李颖 杨秀勇 王传彬 陈西钊 王宏伟 田克恭 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司 犬细小病毒2型(CanineParvovirustype2,CPV一2)在分类上属细小病毒科、细小病毒属，是Eugster等 人于1977年在腹泻幼犬粪便中经电镜检查最先发现的。1978年爆发了世界范围的CPV一2引起的犬出血 性肠炎和幼犬心肌炎，对此病毒的研究开始受到重视。 疫苗免疫接种是预防CPV-2感染的最佳途径。近年来，在使用CPV-2弱毒疫苗时，如何简便、快速 的测定CPV-2的抗体效价，客观评价疫苗的免疫效果是临床上遇到的主要问题。恤常采用血凝抑制试验 检测CPV-2抗体，优点是可以间接反映犬体内CPV-2的中和抗体水平，缺点是操作相当繁锁和费时，且 不能有效区分IG和IEM抗体。因此，以血凝抑制试验做参照.建立一种快速、简便的CPV-2抗体检测方 法I当务之急。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1犬细小病毒细胞培养液:由本公司制备。批号血凝抑制效价:1:51200 1.1.2犬血清:临床收集的警犬、比格犬、宠物犬血清共353份。 1.1.3酶结合物 1.1.3.1辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗犬IgG抗体，购自SIGMA公司。货号:A6792。批号: 022K4836o 1.1.3.2辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗犬坛M抗体，购自KPL公司。批号:04一19一030 1.1.4犬瘟热病毒阳性血清、犬传染性肝炎病毒阳性血清由本公司制备、保存。 1.2方法 1.2.1包被抗原的制备 犬细小病毒细胞培养液，反复冻融三次，超声波裂解处理后，60008低速离心30分钟，收集上清液 1190278超速离心4小时.沉淀用PBS缓冲液溶解、透析。测定其蛋白含tI，加等体积甘油于 20℃保存备 用。 1.2.2抗原包被浓度的确定 将纯化抗原用包被液作系列稀释，用新建立的ELISA方法检测标准阳性血清和标准阴性血清，观察结 果。 1.2.3抗原反应板条的制备 将纯化抗原按一定比例加人到包被液中，混匀;按每孔100pL加人到预包被的微孔反应板内，作用一定 时间后，甩干、洗涤、扣干，每孔加封闭液125KL，再作用一定时间后，扣干、干燥、装人铝铂袋，真空封装，置 4℃备用。 1.2.4酶工作浓度的确定 酶结合物用酶稀释液作系列稀释，用新建立的ELISA方法检侧标准阳性血清和标准阴性血清，观察结 果。 1.2.5加人被检血清和酶结合物后不同作用时间比较 分别作用20分钟、30分钟、45分钟。观察结果。 研 究论 文 1.2.6特异性试验 用建立的ELISA方法，检测已知犬瘟热病毒阳性血清和犬传染性肝炎病毒阳性血清，观察结果。 1.2.7稳定性试验 1.2.7.137℃加速试验:将同批次试剂盒，置37℃分别于0,1,3,5,7,9,12天后，取出板条各一条，用 质控血清进行检测，观察结果。 1.2.7.24℃长期稳定性试验:将同批次试剂盒，置4℃保存.每间隔1个月取出I盒，用质控血清进行 检测，观察结果。 1.2.8血凝抑制试验与ELISA方法的比较 血凝抑制抗体效价大于等于1:80为免疫合格，ELISA方法按说明书进行操作，OD值大于等于Cutoff 值为免疫合格。 1.2.9重复性试骏: 用同批次试荆盒，在3个不同的实验室对已知20份不同OD值的质控血清进行检测，观察结果。 1.2.10血R(HA)和血凝抑制(HI)试验:参照渠川玫等3〔〕方法进行。 2、结果: 2.1纯化抗原的纯度及活性 2.1.1抗原纯度:纯化后的抗原经SDS一PAGE电泳检测，结果显示三条主带，与文献报道犬细小病毒 包含三种主要结构蛋白相符。 2.1.2扰原活性:经血凝试验侧定，纯化后的抗原具有很高的血凝效价，表明纯化抗原具有良好的抗原 抗体反应性。 2.2抗原包被浓度的选择:结果见裹1 从表I可以看出，抗原浓度为1:500时，对标准阳性血清OD值影响不大，但标准阴性血清OD值偏高; 抗原浓度为1:200