AR—GFP融合基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达.pdfVIP

· 2138· 国痘堡生堡盘查 望eJournalofPathophysiology 2008，24(11)：2138—2141 [文章编号] 1000—4718(2008)1l一2138—04 AR—GFP融合基因真核表达载体的 构建及在 HEK293细胞中的表达 刘建伟 ， 叶 玲 ， 刘 静 ， 牛东滨 ， 杜明梅 ， 高宇红 (解放军总医院老年医学研究所，北京 100853；航天医学工程研究所，北京 100094) [摘 要】 目的：构建 由绿色荧光蛋 白(GFP)标记的人醛糖还原酶(AR)融合基因真核表达载体并在 HEK293细胞中表达。方法：应用DNA重组技术构建 AR与GFP的融合基因(AR—GFP)，将 AR—GFP插入 pcD． NA3．1／myc～HisA真核表达载体中，通过磷酸钙共沉淀转染 HEK293细胞，倒置荧光显微镜评价转染效率，Western blotting技术检测AR基因在转染细胞中的整合及表达，分光光度法(uV法)测定AR表达活性，用公认的AR抑制 剂(ARI)反证活性AR的存在。结果：荧光显微镜对转染细胞的观察及Westernblotting结果证实AR—GFP融合蛋 白在HEK293细胞中表达 ，uV法测活、ARI抑制试验均未证实其生物学活性。结论 ：转染的HEK293细胞可成功地 表达AR—GFP融合蛋白，但不能成为ARI真核细胞筛选模型。 [关键词】 醛糖还原酶；绿色荧光蛋白；基因表达；HEK293细胞 【中图分类号] Q7 [文献标识码] A ConstructionoffusionexpressionvectorAR —GFP anditsexpression in Hek293cells LIUJian—wel一，YELing，LIUJing ，NIU Dong—bin ，DU Ming—mel一，GAO Yu— hong (InstituteofGeriatrics，ChinesePLAGeneralHospital，Beijing100853，China；InstituteofSpaceMedciineEngineering， ＆ ng100094，China．E—mail：~e301@yahoo．corn．cn) [ABSTRACT] AIM：ToconstructahARandGFPfusiongenevectorandtoobservetheAR—GFPgeneexpres— sioninHek293ceils．METHODS：ArecombinedvectorpcDNA3．1／myc—HisA—AR—GFP(pH—AG)wasconstruc- tedbygeneengineeringtechnique．TherecombinedvectorWas transfeetedintoHek293cellsusingcalcium phosphate． RESULTS：AR —GFPfusionproteinwassuccessfullyexpressedinHek293cellswithoutbiologicactivity，whichwascon- firmedbyfluorescencemicroscopyandWesternblotting．CONCLUSION：TheHek293cellstransfeetedbyAR —GFPfu- siongenecanexpressitsproteinsuccessfully．However，itisnotacellularmodelforARIscreening． [KEYWORDS] Ad／osereductase；Greenfluorescentprotein；Geneexpression；Hek293cells 绿色荧光蛋 白(greenfluorescentprotein，GFP) 材 料 和 方 法 作为一新型报告分子或定位标记物，已被广泛应用 于示踪活细胞内基因表达、蛋 白转运与定位等，是分 l 材料 子生物学研究中一种流行的实