siRNA沉默G6PD对人结肠癌细胞HIF—1α表达的影响.pdfVIP

· I544· 国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2011，27(8)：1544—1548 [文章编号】 1000—4718(2011)08—1544—05 siRNA沉默G6PD对人结肠癌细胞 HIF一10表【达的影响 张德太 ， 张 科， 杨 文， 胡丽华 (华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科，湖北 武汉 430022) [摘 要] 目的：研究siRNA干扰葡萄糖 一6一磷酸脱氢酶(C,6PD)基因表达的LoVo细胞在低氧环境中还原 型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平的变化及其对低氧诱导因子let(HIF一1ot)表达的影响。方法：构建 靶向C-6PD基因的siRNA干扰质粒载体，并转染人结肠癌细胞株 (LoVo)，用限制性内切酶法结合 DNA测序鉴定特 异重组子，RT—PCR检测G6PDmRNA表达，结合G6PD活性测定判断其干扰效率；以未转染LoVo细胞为对照，进 一 步观察 G6PD沉默的瘤细胞在低氧环境下NADPH水平的变化，RT—PCR检测 HIF—letmRNA表达水平，West． erRblotting检测 HIF—let蛋白水平。结果：成功构建靶向G6PD的siRNA重组质粒载体并稳定转染 LoVo细胞。 与未转染组细胞相比，RNA干扰G6PD使 mRNA表达下降43％，酶活性下降63．5％，细胞内NADPH水平显著下降 (41％vs100％，P0．05)，但 HIF一1mRNA表达水平无明显变化，而HIF—let蛋白显著降低。结论：低氧环境 下 ，C,6PD基因可能通过下调 NADPH水平从而降低HIF一1ot的稳定性，导致其水平下降，进而影响肿瘤细胞的低 氧反应。 [关键词] siRNA；低氧诱导因子 10；【葡萄糖一6一磷酸脱氢酶； Vo细胞 [中图分类号] R735．3 [文献标识码] A doi：10．3969／j．issn．1000—4718．2011．08．016 EffectsofG6PD silencingbysiRNA onexpression0fH腰 一1o【inhuman coloncancercells ZHANG De—tai，ZHANG Ke。YANG Wen，HU Li—hua (DepartmentofLaboratoryDiagnosis，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceTechnolo— gY，Wuhan430022，China．E—mail：Detahangwh@163．con) [ABSTRACT] AIM：Tostudytheeffectsofglucose一6一phosphatedehydrogenase(C,6PD)silencingbysmall interferenceRNA(siRNA)onthelevelsofreducednicotinamide—adeninedinucleotidephosphate(NADPH)andhypoxia — induciblefactor10(【HIF一101)underhypoxiainhumancoloncancercelllineLoVo．METH0DS：SpecificsiRNAex． pressionvectortargetingG6PD genewasconstructed．Therecombinantplasmidwasidentifiedbyrestrictionendonuclease andDNA sequencing，andthentransfectedintoLoVocells．TheeffectsofG6PD silencingwereevaluatedbydetectingthe activityandmRNAexpressionofG6PD．IVocellswereculturedinvitrounderhypoxiccondition．NADPHlevelswerede— termined．ThemRNA andproteinlevels