下游技术 第三章细胞破碎3.ppt

微生物细胞的破碎 微生物细胞的破碎 微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，称为胞外产物。(例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等) 还有许多是存在于细胞内(例如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等)称为胞内产物。 对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液， 对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。 细胞壁的组成和结构 细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放出来。微生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜。 细胞膜使细胞内外保持一定的浓度差，它主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易受渗透压冲击而破碎。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。 细菌的细胞壁 几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固的骨架——肽聚糖组成，是由肽聚糖链借短肽交联而成，使细胞具有一定的形状和强度。 短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L－丙氮酸－D－谷氨酸－L－赖氨酸－D－丙氨酸。 肽聚糖键是N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰胞壁酸交替地通过β－（l→4）糖苷键联接而成。短肽接在N－乙酰胞壁酸上，相邻的短肽又交叉相联，形成了网状结构。 革兰氏阳性菌的细胞壁 革兰氏阳性菌的细胞壁 细菌的细胞壁 革兰氏阳性菌的细胞壁较厚（15－50 nm），肽聚糖占40％一90％，其余是多糖和磷壁酸， 革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄（1.5－2.0nm），最外面还有一较厚的外壁层（8—10 nm），外壁层主要由脂蛋白，脂多糖组成。 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肤键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 酵母菌的细胞壁 主要成分为葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比革兰氏阳性菌稍厚，而且其厚度随菌龄增加而增加。 细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状 覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白， 再外面是由1，6－磷酸二酯键共价连接而成网状结构的甘露聚糖。有甘露聚糖－酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。 真菌的细胞壁 大多数真菌的多糖壁，主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β－（1→3）键连接，某些以β－（l→6）键连接），几丁质（以微纤维状态存在）,糖蛋白。 真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关 它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 几丁质就是由 N- 乙酰葡萄糖胺分子，以 b -1,4 葡萄糖苷键连接而成的多聚糖。 * * 为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）： 多聚糖 （80-90%） 脂类 蛋白质 葡聚糖 （30-40%） 甘露聚糖 （30%） 蛋白质 （6-8%） 脂类 （8.5-13.5%） 肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质 肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%） 主要组成 多层 多层 多层 单层 层次 100-250 100-300 10-13 20-80 壁厚/nm 霉菌 酵母菌 革兰氏阴性细菌 革兰氏阳性细菌 微生物 一、细胞壁的组成和结构 细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固； 酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度； 由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。 二、常用破碎方法 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 改变细胞膜渗透性 冻结融化法 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物 反复冻结-融化 冻结融化法 破碎率较低，常与其他方法结合使用 渗透压剧烈改变 渗透压法 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差 改变细胞膜的渗透性 化学渗透法 具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差 酶分解作用 酶溶法 非 机 械 法 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合 固体剪切作用 X-press法 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作 液体剪切作用 超声破碎法 可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌 液体剪切作用 高压匀浆法 可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难 固体剪切作用 珠磨法 机 械 法 适 应 性 作 用 机 理 分 类 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，