不同乳制品(酸奶)中活性乳酸菌的分离和鉴定.pdfVIP

《微生物学综合实验》实验报告 2012.10 一． 实验目的 1.从乳制品中分离纯化活性乳酸菌 2.利用革兰氏染色等手段对分得菌株进行形态学鉴定 3.通过16SrDNA 序列测定及分析，鉴定分得菌株的种属 4.利用SequenceScanner V1.0软件及MEGA4 软件构建待鉴定菌株的发育树，并进行序 列同源性分析； 5.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察； 6.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术； 7.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器 皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌 8.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。了解酸奶中乳 酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目 的测定的方法 9.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。明确显微镜计数的原理并学习 使用血球计数板 进行微生物计数的方法 10.初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理 和方法，掌握进 行微生物大分子水解试验的原理和方法 11.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生 物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性 二． 实验原理 1. 菌株分离纯化 平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是 将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面 上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而形成多个相互独立的单 菌落。通常认为这种单菌落便为某种微生物的“纯种”。 MRS 培养基是经特殊设计，专门用于乳酸菌培养、富集、分离纯化的培养基。本 实验采用划线分离法，在MRS 培养基上划线稀释不同品牌的酸奶原液，以期分得乳酸 菌纯种。 2. 革兰氏染色 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。通过结晶紫初染和碘 液媒染后，在细菌细胞壁内形成不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其 细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水而使网孔缩 小，再加上其细胞壁不含类脂成分，乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合 物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色。而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、 肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂时，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚 糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后，菌体细胞壁呈无色，再 经番红等红色染料复染，便能使革兰氏阴性菌呈红色。 3. 16SrDNA 序列分析及发育树构建 细菌16SrDNA 序列分析鉴定是一种常用的微生物鉴定方法。rRNA 是研究细菌进 化和亲缘关系的重要指标， 它含量大(约占细菌RNA 总量的80%)，并存在于所有细 菌中。rRNA 基因由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守，素有“细菌化石”之称， 是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。原核生物的 rRNA 分为3 种，分 别为5SrRNA、16S rRNA 和23S rRNA ，并且它们位于同一操纵子上。 rRNA 的基 因在大多数原核生物中都具有多个拷贝，拷贝数目从1 到14 不等。其中，16SrDNA 序 列分析已成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，大约2500 个种的16SrDNA 全序列已 经被报道。根据它们的序列同源性， 已经构建了各种属的系统发育树。 16S rDNA 的扩增需要微生物染色体DNA 作为模板。首先提取微生物的染色体 DNA，以此为模板，加入通用引物进行扩增，对扩增出来的片段提交至NCBI-BLAST 网站进行序列比对并构建发育树，最终得知该微生物的种属归类。 三． 实验材料 1. 样品来源： 本次实验样品购于学校超市销售的光明畅优原味酸奶、蒙牛冠益乳椰果口味酸 奶以及养乐多乳酸菌饮品。 2. MRS 培养基（成分见表 1）： 1 MRS 1 MRS 表 11 MMRRSS 培养基成分 成分 用量 蛋白胨