锌离子螯合剂对LPS诱导的小胶质细胞活化的抑制作用及机制初探.pdfVIP

1．3实时定量PcR(Real—timePcR)法检测各细胞因子mRNA的表达 PcR扩增程序如下：95℃预变性30s；95℃5s，56℃30s，72℃30s并收集荧光，共循 环40次；最后进行Melt检测。结果分析采用2一△洲(Livak法)。 1．4 Western blot法检测pERKl／2蛋白的表达 u 提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取30 g蛋白进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到 PVDF膜，丽春红染色观察转移效果。根据标准分子量蛋白确定待测蛋白的条带位置。含5％脱脂奶 氧化物酶标记的I蜘(1：3000)，室温摇育2h，利用化学发光法进行显色反应，凝胶成像系统摄像， 使用Image J图像软件测量目的蛋白pERKl／2和内参蛋白GAPDH的平均光密度值，以二者的比值， 表示pERKl／2的相对表达量。 1．5统计学方法 所有计量资料数据均采用x±s表示。统计软件为SPSS16．O，采用方差进行分析，尺0．05为显 著性界值。 2结果 2．1 影响 LPS是革兰氏阴性细菌胞壁内毒素的一部分，能诱发体内、外多种炎症反应。细胞接种于六孔 IIMTPEN+LPS组：5pM 板，分别进行如下处理：①LPS组：100ng／mlLPS培养细胞4h；②5 TPEN预 孵育lh，再加LPS培养4ll；◎10pMTPEN十LPS组：10uM pM TPEN预孵育1h，再加LPS培养4h：④25 TPEN+LPS组：25uMTP酬预孵育lh，再加LPs培养4h；⑤正常对照组：加等量减血清培养基培养。 Rea卜ti皿e p、TN卜Q、IL-6 PcR结果显示，与正常对照组相比，LPS组IL_1 mRNA表达水平显著 pMTPEN+LPS、25pMTPEN+LPS组IL—lB、 升高，差异有统计学意义(尺0．01)。与LPS组相比，10 TN卜Q、IL一6血泓表达水平明显下降，差异有统计学意义(尺0．01)(图1)。 2．2 TP斟预处理对LPs诱导的Bv一2细胞中ERK信号通路的影响 组：25pM 培养基培养。以上每组均为3个孔。提取细胞总蛋白，采用westernblot法检测pERK蛋白的表达。 结果显示，与正常对照组相比，LPs组pERK蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义(只O．05)。 2．3 ERK抑制剂PD98059预处理对LPs诱导的BV一2细胞中细胞因子表达水平的影响 25uM B、TN卜n、IL一6 每组均为3个孔。Rea卜timePcR结果显示，与LPs组相比，PD98059+LPS组IL—l mRNA表达水平明显下降，差异有统计学意义(尺0．01)(图3)。 3讨论 锌不仅是一种在细胞新陈代谢中发挥重要作用的微量元素，而且还充当细胞生理功能的调控 者。Z《’可作为第二信使，参与胞内信号转导K。。在AD等神经退行性疾病的动物模型中发现，大量 锌离子从神经元突触前囊泡释放出来，通过直接的神经毒性作用和间接的蛋白聚集作用来诱发脑损 伤，而应用膜渗透性锌离子螯合剂TPEN则可减轻神经元死亡，延缓病情的进展∽3。 小胶质细胞是cNS的巨噬细胞，在神经退行性疾病中起重要作用州。在成熟的正常脑组织中处 374 于静息状态，但是存应激、炎症、损伤等痫理状态下，可被迅速激活。AD患者脑内p一淀粉样斑块 周围有大量反应性的小胶质细胞及细胞闪f工L—lfj、TN卜n的高表达”‘，Cherny等¨”哼【乏道AD转基 因小鼠脑内Ij一淀粉样斑块中锌离子浓度增高，灌胃给予脂溶性锌、铜离子螫合剂氯碘羟喹9周后 §一淀粉样斑块数量