组蛋白和hAMFR基因启动子的结合对体外转录活性的影响.pdfVIP

遗传 学报，26(5):501505,1999 ActaGeneticaSinica 组蛋白与hAMFR基因启动子的结合 对体外转录活性的影响 曾庆华 尹 东 孙迎春 黄百渠 东（北师范大学遗传与细胞研究所 长春 130024) 吕 延 成 解（放军一七一七中心医院 广州 510317) 摘要 采用从鸡血红细胞中分离纯化的组蛋白、从HeLa细胞核中萃取的含有RNA聚合酶11 和多种11类基因转录因子的可溶性抽提物，以及从非洲爪蟾卵细胞核中提取的萃取物热处理 物上清Mrs）用于核小体构建，以含有人自泌移动因子受体 h（AMFR）基因启动子序列的DNA 片段为模板进行体外转录实验，结果表明，组蛋白和转录因子在hAMFR基因启动子序列上的 竞争性结合对转录活性具有重要的影响作用，在启动子区域预先构建的核小体能够抑制转录 活性；反之在启动子上先形成转录起始复合物则能防止核小体的转录抑制作用；当组蛋白和 转录因子同时作用在DNA模板时，转录活性取决于组蛋白和转录因子的相对浓度。 关键词 组蛋白，核小体，转录因子，体外转录 分类号 Q342 真核基因的表达主要是在转录起始水平上进行调控的。由于RNA聚合酶11的基础 转录是一个复杂过程，涉及一系列因子与启动子的相互作用，组蛋白也通过与DNA的结 合对基因的构象和转录活性产生影响。作为染色质一级结构的核小体在转录中有什么变 化和作用？组蛋白和转录因子在与DNA特别是与启动子序列结合过程中的关系及相互作 用对基因转录活性影响如何？这些问题近年来引起很大的研究兴趣1【,21oLorch等人发现 组蛋白并不影响11类基因转录的整个过程，RNA聚合酶一经启动就能够在覆盖有组蛋白 的基因上进行转录，使得mRNA链延长2[]［.Li等发现核小体相对于转录因子结合位点的 位置将影响转录3[]［。本研究通过体外构建核小体和体外转录实验，对组蛋白与转录因子在 398bp的hAMFR基因启动子序列上结合及其对转录活性的影响进行了初步探讨。 1 材料和方法 1.1材料 新鲜鸡血购于市场；HeLa细胞株由白求恩医科大学第一临床医院惠赠；含hAMFR基 因上游398bp的片段由美国密执安癌症基金会提供。非洲爪蟾购自中国科学院发育生物 本文于1998-03-02收到，1998-10-12修回 国家自然科学基金资助项目批（准号 502 遗 传 学 报 26卷 研究所。主要生化试剂:DNA限制性内切酶Stul,Sall,[a32P]-LJTP购自北京亚辉生物 公司，DNA分子量标准价X174DNAIHaelII和dNTP等购自Promega公司。 1.2 方法 组蛋白的提纯参照已发表的方法［.HeLa细胞核抽提物的制备参照已发表的方法[51［0 大肠杆菌的转化及质粒DNA的提纯以及限制性酶切反应按参文 6【1的方法进行。爪蟾卵 细胞核萃取物的制备按参文L［］的方法进行，以hAMFR基因上游398bp片段为模板的体外 转录实验按常规的方法进行t8l，根据加入组蛋白和转录因子的先后顺序分设不同组别。转 录反应在30℃进行 1h，然后加3倍体积的终止反应液，用等体积的饱和酚、氯仿各抽提一 次。水相加冷乙醇，离心沉淀RNA，经7molIL尿素一5％聚丙烯酞胺凝胶电泳后，将凝胶 用保鲜膜包装，覆盖X一光片，一50℃放射 自显影。 2 结果与讨论 为避免组蛋白与DNA产生非特异性沉淀，组蛋白在用于构建核小体之前，首先与爪 蟾卵热处理上清 H（TS)温育形成组蛋白一酸性蛋白复合物，在这种条件下，组蛋白能够在 转录因子结合前或结合后与DNA结合形成核小体，这种实验方法被广泛用于体外微染色 体的构建和进行转录分析实验9[,101a 转录过程采用run-off模式，在转录系统中掺入 a【-32PIL1TP，其转录产物mRNA通过 尿素一聚丙烯酞胺凝胶电泳和放射 自显影进行分 析。相同