09.07.27高三生物《多聚酶链式反应扩增dna片段2》(课件).ppt

三、操作提示 　　1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。 　　2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 三、操作提示 　　3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。 目的： 　　避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。 1、原理： 四、结果分析与评价 1、原理： DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰。峰值的大小与DNA的含量有关。 四、结果分析与评价 四、结果分析与评价 2、具体方法如下。 1）将样品进行50倍稀释：取2μL PCR反应液，加入98 μL蒸馏水。 2）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。 3）加入步骤1中的DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。 4）根据下面的公式计算DNA含量。 3）加入步骤1中的DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。 4）根据下面的公式计算DNA含量。 DNA含量(μg/mL)=50 ×(260nm的读数)×稀释倍数 复习：PCR技术与体内DNA复制的区别 复习：PCR技术与体内DNA复制的区别 1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要； 复习：PCR技术与体内DNA复制的区别 1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要； 2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性； 复习：PCR技术与体内DNA复制的区别 1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要； 2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性； 3. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。 1. DNA单链的________末端为3端，________末端为5端，在DNA复制时，引物从模板链的______端配对结合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子链向下延伸。 2. 每次循环可以分为_________________这三个过程，对应温度分别为_______________________。 练习 （三） PCR的反应过程 1、PCR的反应步骤 1、PCR的反应步骤 　　PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸 （三） PCR的反应过程 ①变性（模板DNA解旋） 　　模板DNA加热至900C以上时，模板DNA双链解离，成为单链。 2、循环过程 靶序列 靶序列 PCR 循环第一步 ：加热变性 ②复性（退火） 　　温度下降到50℃左右，两种引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火 ③延伸 　　温度上升到72℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则，合成一条新的DNA链 PCR 循环第三步 ：引物延伸 靶序列 靶序列 第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列 95℃变性 （1）PCR循环——变性 （1）PCR循环——变性 95℃变性 95℃变性 （1）PCR循环——变性 55℃复性 （2）PCR循环—复性 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 20 30 3 2 1 DNA数量 循环次数 3、30次循环后靶序列扩增的数量 1,048,576 20 1,073,741,824 30 8 3 4 2 2 1 DNA数量 循环次数 3、30次循环后靶序列扩增的数量 4、循环特点： 4、循环特点： ①上一次循环的产物为下一循环的模板 ②结果单链中有最初母链的只两条（无引物存在） ③其它子代DNA分子都为双引物分子 ④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长1×2N 二、实验步骤 ①准备好PCR反应体系的配方 二、实验步骤 ①准备好PCR反应体系的配方 ②用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分 二、实验步骤 ①准备好PCR反应体系的配方 ②用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分 ③盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁 二、实验步骤 ①准备好PCR反应体系的配方 ②用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分 ③盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁 ④离心10分钟 二、实验步骤 ①准备好PCR反应体系的配方 ②用微量移液器按配方在微量