植物RNA的提取及其电泳鉴定.pdfVIP

实验四 植物RNA的提取及其电泳鉴定 一、原理 植物细胞内含有细胞质 RNA 、细胞核 RNA 和细胞器 RNA 。细胞质 RNA 包括 mRNA 、rRNA 、 tRNA 。细胞核RNA 主要有细胞质RNA 的前体及小分子细胞核RNA(snRNA) 、染色质RNA(chRNA) 等。细胞器 RNA 主要指线粒体 RNA 及叶绿体 RNA 。这些RNA 统称细胞总 RNA ，其中大量的是 rRNA ，占 80 ％左右。基因转录产物mRNA 在总 RNA 中只占 1％～5 ％。不同的mRNA 在分子大 小、核苷酸序列，以及在细胞内转录水平等方面各不相同，但真核细胞 mRNA 3 ˊ末端都具有20～ 200 个不等的多聚腺苷酸的尾，称为 poly(A)结构。利用 poly(A)结构可以把 mRNA 从总 RNA 中分 离出来。对于 Northern 杂交可以使用植物细胞总 RNA ，也可以使用由总 RNA 中分离出的mRNA 。 植物细胞 RNA 提取中的主要问题是防止 RNA 酶的降解作用。RNA 酶是一类水解核糖核酸的 内切酶，它与一般作用于核酸的酶类有着显著的不同，不仅生物活性十分稳定，耐热、耐酸、耐 碱，作用时不需要任何辅助因子，而且它的存在非常广泛，除细胞内含有丰富的 RNA 酶外，在实 验环境中，如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液、甚至灰尘中都有 RNA 酶的存在。因而，生物体 内源、外源RNA 酶的降解作用是导致 RNA 提取失败的致命因素。 内源RNA 酶来源于材料的组织细胞，提取自始至终都应对 RNase 活性进行有效抑制。RNA 提取过程中将蛋白质变性剂与 RNase 抑制剂联合使用效果较理想。蛋白质变性剂包括酚、氯仿、 SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸钠) 、DOC(脱氧胆酸钠) 、盐酸胍、异硫氰酸胍、4—氨基水杨酸钠、 三异丙基萘磺酸钠等；RNA 酶抑制剂有 RNasin(RNase 阻抑蛋白) 、氧钒核糖核苷复合物等。 外源 RNA 酶的抑制主要是使用 DEPC(焦碳酸二乙酯 C Hs-O-CO-O-CO-O-CxH ) ，它能与 2 5 RNase 分子中的必需基团组氨酸残基上的咪唑环结合而抑制酶活性，用于水、试剂及器皿的 RNase 灭活。DEPC 与肝素合用效果增强，值得注意的是 DEPC 在 Tris 溶液中很不稳定，很快分解成 CO2 及 C H OH，因而不能用于 Tirs 溶液的 RNase 灭活。水及其它溶液的灭活一般使用 0.05 ％～0.1 ％ 2 5 DEPC ，37℃处理过夜，也有人采用磁搅 0.5 小时以上的做法。DEPC 处理后的溶液还需高压灭菌， 以去除残存的DEPC 。若DEPC 去除不净，会破坏 mRNA 活性。不能高压灭菌的试剂要使用经过 DEPC 处理的灭菌蒸馏水配制，然后用 0.22 μm 滤膜过滤。含有 Tris 的试剂用经DEPC 处理过的 水配制，再经高压消毒。玻璃器皿可以在 180℃烘烤 8 小时以上，不能烘烤的器皿用 0.1 ％的DEPC 水处理过夜后再高压灭菌。 提取全过程必须在清洁无尘的环境中进行。操作人员要使用一次性的手套拿取物品，尽可能 避免一切污染机会。提取时使用的器皿应经过硅烷化处理，以防止 RNA 被吸附在器皿壁上，造成 损失。RNA 电泳使用的电泳槽需用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥。再浸入 3 ％ H202 溶液中， 室温下放置 10 分钟以上，再用 DEPC 溶液处理过的水冲洗干净。总之，实验中所用的试剂、器皿 都要经过 RNase 灭活处理。 尽管如此，有时还会出现在提取的后期 RNA 被降解的问题。这是因为 RNase 活性的抑制只 是一个暂时的现象，一旦抑制剂浓度下降 RNase 就有可能恢复活性。对于 RNA 提取来说，这是 一个潜伏的危险。在提取的前阶段，提取液中无疑是有足够的抑制剂，但到了提取后期，抑制成 分逐渐减少，残存的 RNase 就会复活而引起 RNA 降解。另外，提取后期发生的 RNase 污染，那 怕是极轻微的，也会使到手的产品降解，因而提取后期要更加小心。 影响植物 RNA 提取的另一个问题是水溶性的细胞代谢物如酚、多糖等易与 RNA 结合成胶冻 状的不溶物或有色的复合物，它们能影响 RNA 的质量及产量。人们采用了多种处理方法来解决这 个问题，如对组织提取液进行高速离心去除多糖；采用低 pH