家蚕血淋巴蛋白的发育变化的BmLSP的纯化.pdfVIP

维普资讯 2001年 9月 安徽大学学报弋自然科学版) Seotember2001 第25卷 第 3期 Journal AnhuiUnive~tyNautra1．ScienceEdilion V ．25 No 3 家蚕血淋 巴蛋 白的 发育变化和 BmLSP的纯化 葛宏华 ，孙莉宁 ，张其瑞 (1安徽大学 现代实验技术 中t5，安徽 台肥 230039； 2．安徽省环保局，安徽 台肥 230061；3中国科技大学 生命科学学院，安徽 台肥 23(xr27) 摘 要 ：对 1—5龄 的家蚕幼虫血淋 巴取样 ，通过十二烷基硫酸钠 一聚丙酰胺凝胶 电泳 (SDS—PAGE)观察并分析家蚕幼虫血淋巴主要蛋 白的发育变化 ，对其 中的一种主要蛋 白即家 蚕幼虫血清蛋 白，通过硫酸铵沉淀、阳离子交换柱层析 、凝胶过滤纯化至均一 。 关键词 ：家蚕 ；血淋巴；幼虫血清蛋 白 中围分类号 ：Q966 文献标识码 ：B 文章编号 ：1000—2162(2001】03—0091—04 0 引 言 昆虫具有开放性血管系 ，组织液即淋巴液和血液混合 ，合称为血淋巴。昆虫血淋巴在体 内行使重要 的生理功能如 ：免疫功能，作为种种代谢中间体 ，输送营养成分给各个需要 的细 胞组织 ，输送激素等低分子物质 ，做为蛋 白质临时的储藏所等。 在蚕血淋巴中，蛋 白质为其主要成分 ，目前物理化学性质或生理机能比较清楚的主要有 以下几种：一直存在于蚕体中的载脂蛋 白(J『P)；随发育阶段量上有所变化的储藏蛋 白(SP)； 一 类随发育阶段而出现在五龄幼虫血淋巴中的小分子脂蛋 白，因其分子量约为三万 ．常称为 30kp或是 30kd蛋 白…。还有一种雌性幼虫特有的卵黄原蛋 白(vg)。 30kp蛋 白和 Vg出现在卵黄小球 中…。Fujiwara和 Famashita发现 ，在 30kp蛋 白出现 以 前，家蚕血淋 巴中一直稳定存在着一种分子量也为 30KD的蛋 白质 ，他们通过免疫学方法表 明，它与 30kp蛋 白不同，并命名为家蚕幼虫血清蛋 白(BmLSP) 。 对每天的家蚕幼虫血淋 巴取样 ．通过 SDS—PAGE检测血淋 巴中 、VE、30kp和 BmLSP 的存在及其发育变化 ，并用五龄第一天的幼虫血淋 巴进行 BmLSP的提取纯化工作 ，为进一 步探讨结构和其功能打下基础 。 1 实验部分 1．1 实验材料 1—5龄家蚕 (新九三)，安徽省农科 院蚕桑研究所 ；M．gTAFPLC系统 ，安发玛西亚公司 ； 电泳仪 ，Bio—Rad公司；柱层析系统 ，LKB公司；凝胶成像 系统 ，安发玛西亚公司；冷冻干燥 器，日本 NIHON冷冻机有限公司。 收稿 日期 ：2001—03—09 作者简介 ：葛宏华(1973一)，男，安徽巢湖人 ，安徽大学工程师 维普资讯 安徽大学学报 (自然科学版 J 第 25蔷 溶液 A：50ns~l磷酸缓冲液 +400raM氯化钠 +ImMPMSFpH7．0 溶液 B：50ram磷酸缓 冲液 +150ram氯化钠 +数粒苯硫脲 晶粒 pH7．O 溶液 C ：25rm~|磷 酸缓冲液 pH72 溶液 D 25mM 乙酸缓冲液 pH5．7 溶液 E：25mM磷酸缓冲液 +100raI~l氯化钠 pH72 1．2 方 法 12．1 样 品的收集 一 、二龄幼 虫 ，取整个幼 虫体 ，加入适 量溶液 A进行研磨 ，三 、四、五龊 幼虫 ，用剪刀剪去其触角或足基部 ，待血淋 巴流 出时立 即收集 ，并快速加入溶液 B，上述溶液 在 4oc12，00Og离心 5rain，取上清液通过 sDs～PAGE用于蛋 白质分析 。 1．2．2 发育