鱼类肌肉蛋白的提取.docVIP

实验二 鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 实验目的和内容 （一）目的： 了解从动物组织中提取蛋白的原理和实验方法； 熟悉蛋白质含量测定的各种方法和基本原理，并根据实验结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异； 掌握SDS的原理和垂直板型凝胶电泳的操作方法，并根据电泳结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。 （二）内容： 利用机械破碎和高速离心分离等手段，从不同种类的鱼肌肉中提取水溶性蛋白和盐溶性蛋白； 采用紫外吸收法测定以上各蛋白提取液中的总蛋白含量； 对以上蛋白提取液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）检测，并利用凝胶成像系统软件对电泳结果进行分析。 实验原理 蛋白质在组织或细胞中一般都以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此，蛋白质的提取、分离和鉴定工作是生物工程中一项十分艰巨的任务。要想分离提纯某一特定的蛋白，首先必须把蛋白质从组织活细胞中以溶解的状态释放出来。为此，动物组织或动物细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎，细菌和植物细胞可用超声破、高压挤压或砂研磨等方法进行破碎。 鱼肉蛋白水解酶肌原纤维蛋白质00×g，离心15min，将上清和沉淀分开。 上清用四层纱布进行过滤除去脂肪，滤液即水溶性蛋白提取液（留样1（1.5ml）、量体积、测蛋白含量、SDS化） 在以上沉淀中，加入30 ml 冰冷的蒸馏水，重悬沉淀，在4℃下，10000×g，离心15min， 取沉淀。 重复操作4二次。 在以上沉淀中，加入30 ml 冰冷的Buffer II（Buffer I含有0.5M NaCl），重悬沉淀，再次用组织捣碎机进行捣碎。 将以上匀浆转入50ml 离心管中，在4℃下，8000×g，离心15min，将上清和沉淀分开。上清即为盐溶性溶性蛋白提取液（留样2（1.5ml）、量体积、测蛋白含量、SDS化）。 （二）蛋白含量测定——紫外吸收法 取适量的样品提取液（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液），根据蛋白质浓度，用Buffer I适当稀释后，用紫外分光光度计分别在280 nm和260 nm波长下读取吸光度，以Buffer I为空白调零。 结果计算： 蛋白质浓度= n ×（1.45 A280－0.74 A260）（mg／mL） 式中：l.45和0.74为校正值； A280为蛋白质溶液在280nm处的吸光度； A260为蛋白质溶液在260nm处的吸光度； n为稀释倍数。 （三）蛋白提取液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 1． 聚丙烯酰胺凝胶的配制（1）分离胶(12%)的配制（10ml）：?? ddH2O 3.3 ml?? 30%储备胶 4.0 ml?? 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 2.5 ml?? 10% SDS 0.1 ml?? 10% AP 0.1 ml TEMED 4 μl? 混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平（凝胶完全聚合需30-60min）。 （2）积层胶的配制（5ml）： ddH2O 3.4 ml 30%储备胶 0.83 ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.63 ml 10%SDS 0.05 ml 10%AP 0.05 ml TEMED 5 μl 将分离胶上的水倒去,加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间（完全聚合需15-30mim）。 2．样品处理：将样品（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液）加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热5min，离心12000g×1min，取上清作SDS分析，同时将SDS分子量蛋白标准品作平行处理。 上样：分别取10μl处理后的样品加入样品池中，并加入6μl蛋白标准品作对照。 电泳：在电泳槽中加入1(电泳缓冲液，连接电源，注意正负极接向。电泳时，刚开始电压控制在90V，当样品到达分离胶后，可将电压调至180V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止。 染色：将胶从玻璃板中小心取出，用考马斯亮兰染色液染色。 脱色；将胶从染色液中取出,放入脱色液中，脱色至蛋白带清晰。 凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，并利用系统软件分析实验结果，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。