侧孢短芽孢杆菌侵染性蛋白酶的表达及其随机突变文库的构建.pdf

中文摘要 中文摘要 植物寄生线虫是植物的重要病害之一，已成为制约农业生产良好发展的重要因 素。生物防治线虫具有对环境和人类危害小并且不会产生抗药性的优势，已成为线 虫防治的研究热点。然而以天然活菌剂为基础的生物杀线剂毒力小、稳定性差对温 度敏感造成实际生防效果缓慢效率低下。因此，研究食线虫微生物侵染线虫的毒力 因子及其作用的分子机制对提高生物杀线剂的稳定性和毒力，促进生物杀线剂的实 际生防效率具有重要的意义。侧孢短芽孢杆菌G4产生的丝氨酸蛋白酶BLG4是强 杀线虫的主要毒力因子，是研究丝氨酸蛋白酶侵染线虫机制的理想材料。本论文通 过蛋白质定向进化技术研究丝氨酸蛋白酶降解线虫体壁并杀死线虫的结构基础和分 子机理。 通过对16SrRNA基因序列的分析，从分子水平上确认出发菌就是具有高效杀 线虫毒力的Brevibacillus laterosporus G4的发酵培养体系，获得的培养体系摇瓶 设计和响应面法设计优化丑laterosporus 发酵30小时蛋白酶活力可达12379U／ml，比优化前提高了5倍。 采用单因素设计试验对芽孢杆菌转化体系进行优化，获得的转化系统电转效率 可达6．0×104 cfu／ggDNA，存活率达到3．O％；分别利用枯草芽孢杆菌整合型表达载 subtilis 组表达质粒，并成功实现在B WB600中的稳定高效和高通量表达。 运用易错PCR技术扩增蛋白酶BLG4的成熟肽片段，然后采用重叠延伸PCR 18 Vector构建库容约 技术获得具有完整编码区的突变基因，连接到pMD．TSimple 为5．1×104cfu、突变率为0．536％的高质量蛋白酶BLG4的随机突变文库。应用丑 subtilis WB600表达体系构建蛋白酶BLG4的随机突变表达文库，高通量筛选获得热 稳定性得到较大改善的突变体Mut．01。通过对突变体Mut．01的氨基酸序列和模拟 体的空间结构更加紧凑稳定是热稳定性提高的主要原因，为提高生物杀线剂的实际 生防稳定性提高了理论基础。突变文库的构建及其分析为下一步筛选侵染线虫活性 发生改变的突变子，研究侵染酶降解线虫体壁的结构基础和分子机理奠定了基础。 关键词 侧孢短芽孢杆菌，线虫，丝氨酸蛋白酶BLG4，侵染机制，随机突变文库， 定向进化 中文文摘 中文文摘 植物寄生线虫是植物的重要病害之一，全世界每年由于植物寄生线虫病害所引起的农 作物经济损失达到1000亿美元。在我国，线虫危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花 生、小麦、水稻、林木、中药材等许多农作物，严重制约了农业生产的良好发展。如今所 使用化学防治，由于对环境的破坏以及对人畜安全性的影响，其使用正逐步受到限制。因 此，生物防治植物寄生线虫的迫切性和重要性日渐显著。线虫的生物防治主要是采用以食 线虫微生物为基础的天然活菌剂做为生物杀线剂，而对植物寄生线虫具有良好控制作用的 食线虫细菌因其生长快速、易于培养的优势正逐步成为新的研究热点。然而以天然活菌剂 为基础的生物杀虫剂，其毒力小、稳定性差对温度敏感，在大田中的实际生防效果远没有 化学农药直接与快速。因此，深入研究参与食线虫微生物侵染线虫的毒力因子及其作用的 分子机制，对提高生物杀虫剂的毒力和稳定性、解决线虫生防制剂在实际应用中防效低下 的问题具有重要意义。 食线虫微生物对宿主的侵染是一个复杂的过程，其主要步骤包括：识别、吸附、穿透 和消解等，而食线虫微生物在侵染过程中产生的胞外侵染性水解酶(蛋白酶、胶原蛋白酶 和几丁质酶)在穿透线虫体壁和消解线虫组织的过程中起了非常关键的作用。侧孢短芽孢 杆菌G4菌株中分离出的侵染性胞外蛋白酶BLG4是其侵染线虫的主要毒力因子，能够降 解线虫体壁并帮助其进入体内杀死线虫，并且侵染线虫的活性与蛋白酶活力成正相关。芽 孢杆菌作为革兰氏阳性菌能够高效地表达异源蛋白基因并分泌到细胞外是原核表达系统 中分泌表达外源蛋白较理想的宿主。酶的定向进化技术是一种在生物体体外模拟达尔文进 化的、快速的、具有一定目的性