分离纯化中蛋白质的不稳定性与其对策.pdfVIP

《生物工程进展》2000 ,Vol . 20 ,No . 3 分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策 冯小黎 　金业涛 　苏志国 ( 中科院遗传所人类基因组中心 ,北京 　100 10 1) ( 中科院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室 ,北京 　100080) 摘要 　分离纯化出高纯度有生物活性的蛋白质一直是一项艰巨的工作 。在基因工程药物蛋白质 的生产中 ,收率低和纯度低是亟待解决的关键问题 。这里除了生物组份复杂 、难以分离外 ,许多 目 标蛋白质自身活性的丧失也是一个重要原因。由于药物蛋白质昂贵的市场价格 , 回收率稍有提高 就有可能带来巨大的经济效益 ,所以,有关蛋白质在分离纯化中的失活及其对策在近年来受到了 极大的关注 。1997 年第十届欧洲生物技术大会上 ,蛋白质的稳定被单独列为一个专题 。1999 年 在加拿大召开的第九届生物产品回收技术会议也对蛋白质的稳定性进行讨论 。目前重点探索的 是蛋白质失活的机制 ,采取相应的对策以保护活性 ,并在分离纯化中采用高效的分离纯化技术缩 短操作周期 ,提高产物的活性回收率 。 关键词 　蛋白质 　稳定性 　分离纯化 可能导致失活 ,主要的机制有 : 1 　蛋白质失活的机制 ) ( 1 聚集 有时伴随分子和分子间二硫键的形 蛋白质的三维结构是由疏水相互作用、静电相 成) 互作用 、氢键 、范德华力这些弱相互作用力及二硫键 2) 酶失去辅酶 所维持的。它们 的稳定 自由能 ΔGst ab 一般低于 3) 寡聚蛋白质解离成单体 60 KJ / mol , 构象稳定性很低[ 1 ] 。在分离提纯过程 4) 吸附于容器表面 中 ,搅拌 、升温 、p H 变化 、盐浓度变化 、添加表面活性 5) 不正确的折叠形式或形成错配的二硫键 剂或有机溶剂等是分离提纯难以避免的结果和所必 从动力学上讲 ,蛋白质在提纯过程中活性的丧 需的操作 ,但这些结果和操作对大部分蛋白质都有 失可能是由天然状态 N 经过一系列相对稳定的中 造成结构变化的可能 。甚至 目标蛋白质自身浓度的 间态 U 1 ,U2 . . . 而最终达到变性状态 D[3 ] : 变化也有可能造成三维结构的变化 ,导致失活 。失 N U 1 U2 … D 活的蛋白质就成为杂质 ,不仅无用 ,还可能有毒 。在 一些蛋白质处于中间状态时仍具有部分活性 , 分离提纯中蛋白质发生失活的机制有多种 ,概括起 是一个可逆过程 ,而成为变性态则有的是可逆的 ,有 来有 : 的是不可逆的。 1 一级结构被破坏 ,导致三维结构的变化 ,造成失 11 　蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 活 : 疏水相互作用对维持蛋白质的天然结构起重要 ) ( 的乃至决定性的作用[4 ] 。Yat ani 等人证实蛋白质的 1 肽键的酸水解和酶水解 在 A sp 的羧基侧 链上最迅速) 稳定性与疏水性之间在一定的关系 。而疏水性取决 2) Cys 、Trp 、Met 的氧化 于蛋 白质 分 子 内部 疏 水 性 氨 基 酸 的个 数[5 ] 。 3) 二硫键被还原 ,伴随β—消失和 —SH 形成 Mozhave 等分析了嗜热酶的稳定性为什么比