牦牛黑素皮质素受体-4(MC4R)基因的克隆测序及其多态性分析.pdf

摘 要 黑素皮质素受体-4(MC4R)是下丘脑腹内侧核(VMH)分泌的一类肽类物质,为黑素皮质素家 族 5 个成员之一。MC4R 属于 G-蛋白耦联受体(GPCRS)超级家族,为跨膜神经受体，是一个调节 能量平衡与能量动态平衡的重要的信号分子。本研究以大通牦牛、野牦牛和犏牛为研究对象， MC4R 基因的编码区进行PCR 扩增和克隆测序，在对牦牛MC4R 基因进行序列分析的基础上， 对 与GenBank 中其它物种相应基因核苷酸序列、氨基酸序列进行了比对分析，并构建了牦牛与其 它物种间系统进化树。得到以下结论： ①克隆得到的牦牛MC4R 基因全长 1434bp,其中编码区为999bp,编码332 个氨基酸。 ②大通牦牛、野牦牛、犏牛和普通牛(Bos Taurus,AF265221)的MC4R 基因在编码区内，共 发现6 处碱基差异，大通牦牛与普通牛在40bp(G/A)、69bp(T/C)、865bp(G/C)、918bp(G/C)、 945bp(T/C)5个位点上分别发生碱基转换或颠换；大通牦牛与野牦牛在69bp(T/C)、945bp(T/C)2 个位点上分别发生碱基的转换；大通牦牛与犏牛在 69bp(T/C)、865bp(G/C)、945bp(T/C)、 949bp(A/G)4 个位点上分别发生碱基转换或颠换。而大通牦牛、野牦牛和犏牛三种牛与普通牛 分别有5、3、3 次碱基差异。 MC4R 的氨基酸序列比较结果表明，4 种牛之间共有3 ③大通牦牛、野牦牛、犏牛和普通牛 处氨基酸存在差异, 其中在第 11位大通牦牛、野牦牛和犏牛均为Ala(A),而普通牛为Thr(T)； 在 286 位大通牦牛和野牦牛为Val(V)，而犏牛和普通牛为Leu(L)；在 314 位大通牦牛、野牦 牛和普通牛为Lys(K)，而犏牛为Glu(E)。 ④通过PCR-SSCP 分析发现，在大通牦牛MC4R 基因扩增片段中，引物 2 和引物 6 存在多 态性，其余 4 对引物均未发现多态性。引物 2 存在 3 种基因型（AA、BB、AB）,引物 6 存在 2 种基因型(CC、CD)。经χ2 适合性检验，两对引物的突变位点均不符合Hardy-Weinberg 平衡状 态。测序发现引物2 的 AA 型与BB 型相比在该片段的第 138bp处有一个G→A 的单碱基突变， 该突变导致氨基酸的改变：由Ala（A）转变为Thr（T）；引物6 的CC 型和DD 型相比在该片段 的第21bp 处有一个C→G 的单碱基突变，该突变没有导致氨基酸的改变。 MC4R 基因与牦牛肥胖性状的研究，以及基 上述结果在牦牛中均为首次报道，为今后开展 因定位、表达调控和牦牛育种提供了必要的理论基础。 关键词：牦牛，MC4R 基因，克隆测序，PCR-SSCP I Abstract The Melanocortin Receptor 4(MC4R),a polypeptide,is one of the five melan-cortexin family numbers,secreted by ventromedial hypothalamic nucleus(VMH).MC4R ,as a transmembrane neurorerecepor, pertaining to G-protein-coupled receptor(GPCRS)superfamily. It is a significant signal molecule in regulating energy balance and energy dynamic balance. Datong yak, Wild yak and Cattle-Yak are researched in this study. MC4R gene of the yak is cloned by the T-A method