颅脑创伤后亚低温脑保护的机制：钙蛋白酶Calpain及相关底物MAP-2的的研究.pdf

上海交大医学院博士论文 颅脑创伤后亚低温脑保护的机制：钙蛋白酶Calpain及相关 底物MAP．2的研究 摘要 大量动物实验及临床试验均证实亚低温治疗能减轻颅脑创伤后 病理损害的程度，促进神经功能恢复，但其保护作用的机制仍未完全 明了。其中尚有许多未能彻底阐明或印证的环节以及相互作用关系， 而且在亚低温治疗的方法学上也存在着许多热点问题，一直也是科学 界研究的重点。其机制研究也由生化、代谢水平深入至分子水平，人 们开始从分子水平阐述亚低温脑保护的作用机制。 Calpain是中枢神经半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，通常以没有 活性的酶前体形式存在于神经元内，胞内Ca2+超过一定阈值时可激活 此酶。Calpain持续激活导致蛋白和酶的大量水解。主要集中于它对 经丝(Neuronl锄ent)的水解破坏从而参与继发性脑损伤。目前，在颅 脑外伤模型中，尚无报道亚低温脑保护治疗对Calpain)及其作用底物 MAP．2的基因或蛋白表达的作用。因此，本实验将研究颅脑外伤后动 物脑组织Calpain及其作用底物MAP．2的基因和蛋白的改变，以及亚 低温脑治疗对其产生的影响。 本实验分为三部分：第一部分：大鼠液压冲击脑损伤后亚低温和 常温模型的建立；第二部分：颅脑外伤后亚低温治疗对Calpain基 因和蛋白表达的作用；第三部分：亚低温对颅脑外伤后大脑组织 上海交大医学院博士论文 MAP．2基因和蛋白表达的影响。 第—部分大鼠液压冲击颅脑损伤后常温和亚低温治疗模型的建立 目的：理想的颅脑损伤动物模型是研究颅脑损伤机制及其诊疗方法的 重要平台。建立常温和亚低温条件下液压冲击脑损伤动物模型。评估 致伤模型的有效性及伤后脑组织的改变是否符合实验要求。为深入开 展颅脑创伤的相关动物实验研究奠定基础。 方法： (1)实验动物及分组：雄性SD大鼠30只，随机分为：假手术组 (2)液压冲击脑损伤动物模型建立：实验动物2％戊巴比妥钠经腹腔麻 醉，固定头部于动物立体定位仪。头皮正中切1213cm，剥离骨膜，前 囟人字缝尖连线中点偏右4mm颅钻钻孔，骨窗直径4．8mlTl，暴露完 整硬脑膜。颅骨固定螺丝两枚，置入内径2．6mm打击管，牙科骨水泥 牢固固定后缝合消毒头皮切口。 术后予气管插管，股动脉置管，动 物用多导生理监护仪监测动物血压、心率变化。动物出现夹足反应时， 80--200 用液压脑损伤打击仪压力1 l(P造成中度脑损伤。手术过程用 温度计及脑温仪监测肛温和颞肌温度。假手术组同样行颅骨钻孔和埋 管处理，但未遭受打击损伤。(3)亚低温治疗的实施：亚低温组脑损伤 后将动物置于降温毯上，30min内脑温及肛温降至32。C,-．．,33℃，应用 h。 加热垫及冰袋维持亚低温4h。常温组伤后保持体温(37+0．3℃)4 (4)指标检测和采集：各组均进行生命体征监测、神经行为学评分、大 上海交大医学院博士论文 体标本观测和病理切片观察。研究标本采用低温下取大鼠受伤大脑皮 层周围组织，液氮保存。 结果：结果显示，各组大鼠成功建立液压脑损伤及亚低温模型， 常温组伤后维持体温(37士0．3℃)4h，亚低温组维持体温(32．5+0．5C) 4h。通过损伤前后表现及病理生理功能的监测，证实致伤装置能导 致大鼠致伤后出现明显的改变，尤其损伤早期各指标变化明显，病理 形态学显示中度脑损伤改变。亚低温过程中大鼠动脉血压、心率、呼 吸等指标基本保持正常范围。 结论：实验结果显示，该动物模型与临床上接受亚低温治疗的颅 脑损伤患者的病理学改变和病理生理特点极其相似，符合实验要求。 我们成功地建立了大鼠常温和亚低温颅脑损伤模型，为下一步亚低温 脑保护机制的研究提供了良好条件。 关键词：颅脑创伤，液压冲击模型，亚低温，大脑皮层，Calpain， MAP．2 第二部分颅脑外伤后亚低温治疗对Calpain基因和蛋白表达的作用 要集中于它对细胞骨架蛋白，即血影蛋(Spectrin)、微管相关蛋白 伤。亚低温治疗对calpain活性