如何阅读质粒图谱.pdfVIP

生物秀实验频道——生命科学实验中心 ！  /bio101/  如何阅读质粒图谱 如 何 阅 读 质 粒 图 谱 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点 Oril  即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始 点。而真核生物 DNA分子有多个复制起始位点。 ＃抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+l ,Kan+  ＃多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 l  ＃P/E 启动子/增强子 l  ＃Termsl 终止信号 ＃加 poly （A）信号 l 可以起到稳定 mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解 β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor （kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶使 G418 （长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素 β失活。 第三步：看多克隆位点 （MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。 如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定 能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步： 再看外源 DNA插入片段大小。 质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA片段。 一般来说，外源 DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信 号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即 成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 ＃启动子－促进 DNA转录的 DNA顺序， 这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的 上游，是 DNA分子上可以与 RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本 身不被转录。l  ＃增强子/沉默子－为真核基因组 （包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因 转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或 下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。l  ＃核糖体结合位点/起始密码/SD 序列 （Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位 点，对于原核而言是 AUG （起始密码）和 SD序列。l  ＃转录终止顺序 （终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个  AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同 构成 poly （A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列， 此位点 down－stream有一段 GT或 T富丰区，这 2部分共同构成 poly （A）加尾信号。  l 回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针， 那其实是代表两条 DNA链，即质粒是环状双链 DNA，它的启动子等在其中一条链上， 而它的抗性基因在另一条链上.  三、介绍一下关于载体的知识 （虽然课本上都有写）  1. 什么是载体 生物秀论坛——资源共享、学术交流、互助社区  /bbs/  生物秀实验频道——生命科学实验中心 ！  /bio101/  即要把一个有用的基因 （目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细 胞 （受体细胞），需要运载工具 （交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工 具就叫做载体（vector）。  P.S.基因工程所用的 vector 实际上是 DNA 分子，是用来携带目的基因片段进入受体细 胞的 DNA  2. 载体的分类 ＃按功能分成： （1）克隆载体都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它 是用来克隆和扩增  DNA  片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注 意是不是使用的严谨行载体）