PRRSV变异株Nsp2基因的克隆、原核表达及其ELISA方法的初建.pdfVIP

中文摘要 中文摘要 高致病性猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株引起的以持 续高热为主要特征的猪的一种急性传染病，其显著特点是高发病率和高死亡率。Nsp2 基因是高致病性猪繁殖与呼吸综合征与普通猪繁殖与呼吸综合征之间及其各分离株 间变异最大的基因之一[1】。本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株SCM 为材料，扩增克隆Nsp2基因上的一段抗原决定区域，同时利用所获得的目的基因进 行序列分析、原核表达载体构建、原核表达及其ELISA检测方法的初步建立。 I、Nsp2基因的分子克隆与序列分析 6．0软件辅 参照PRRSV变异株SCJX01上的Nsp2基因核苷酸序列，利用Oligo 助设计并合成了一对特异性引物，提取以Marc．145细胞增殖培养的PRRSV变异株的 化到感受态细胞E．COLI DH5。中，用TA克隆法将所得基因片段克隆在pMDl8．T载 体中，构建克隆重组质粒pMD-Nsp2，并经PCR和酶切鉴定正确后，将阳性克隆菌 送公司测序，序列测定显示，克隆出长为523bp的Nsp2上的一个基因片段，编码166 个氨基酸。将测序结果及推导的氨基酸序列与国内外的不同分离株进行生物信息学分 相比核苷酸同源性在64．7％，与国内早期分离经典株相比核苷酸同源性为89．4％～ 与普通株相比具有很强的可变性，且在现有变异株中缺失变现较为一致，但与Nsp2 上的高缺失区域比较相对保守。 II、Nsp2基因的原核表达 I、Sac 构建原核表达质粒pET-Nsp2。筛选出阳性重组质粒，并转化入表达宿主菌BL21 (DE3)，参考实验室已有的最佳条件，用0．5mmol／LIPTG进行诱导表达，表达产物 blot) 经十二烷基磺酸钠聚丙酰氨凝胶电泳(SDS．PAGE)和免疫印迹实验(Western 验证了表达产物大小正确、是具有免疫活性的蛋白，同时检测其可溶性。结果表明， 中文摘要 原核表达质粒pET-Nsp2表达的目的融合蛋白以包涵体形式存在，大小约为38Kd，占 菌体总蛋白的22．5％，在37℃、5h表达产物最高。 III、Nsp2基因表达蛋白的纯化及其ELISA检测方法的初步建立 对诱导表达后以包涵体形式存在的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株 白作为包被抗原，并对抗原的包被，作用时间及底物的选择等条件进行优化，最后通 过特异性试验、重复性试验、阻断试验以及和标准试剂盒进行对比等方法检验己建立 的ELISA方法的效果，初步建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株抗体 的间接ELISA方法。研究结果表明，ELISA最佳工作条件为：重组抗原最适包被质量 浓度为17．5ug／mL，最适包被条件为4。C过夜，血清稀释度为1：40，血清和酶标二抗的 学分析后确定阴阳性的临界值为0．33。各项检测试验的结果表明此方法特异性强、重 盒相比较，其相对特异性和敏感性分别为98．1％和91．5％，符合率达到90．O％，检测 结果无显著性差异。 试验克隆并表达了PRRSV变异株的Nsp2基因中抗原性较强的一个基因片段，与 国内外分离的其他毒株的Nsp2基因进行数据比较，并且初步建立了其ELISA方法的 检测。从生物信息、分子生物、免疫原性等方面对Nsp2基因进行了研究，对深入探 讨Nsp2基因功能以及为PRRSV变异原理更为详尽的研究进展提供了基础数据。 RT-PCR基因克隆’序列分析原 关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒变异株Nsp2 核表达ELISA 2 中文摘要 and ofPorcine and