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ELISA操作流程.doc
ELISA操作流程
前处理
1.匀浆样本:
取一定量(约100-150g)的样本进行匀浆,匀浆样本以无颗粒状为为佳。样本匀浆好以后再利用称样勺搅拌样本,以充分混合不同个体的样本,达到均质的效果。
2.称量样本:
利用0.01g当量的电子天平称量相应的样本重量,误差尽量控制在±0.02g,以提高结果的准确度。样本直接称取到50ml离心管中。称量的样本应尽量称取匀浆效果比较好的样品。
3.加入提取液:
在相应的样本中加入对应的提取溶剂,溶剂的体积在条件允许范围内尽量精确。
4.提取或萃取:
加入相应的提取溶剂以后,拧紧离心管盖,利用涡旋仪充分振荡样品,以样本与提取液充分混合为准。具体时间可参考说明书所提供的方法时间要求。
5.离心:
把处理好的样品对称放置在离心机中,盖上离心机盖门,直到听到离心机盖门关闭声音,按“离心”键进行离心,离心时间一般设为5min,离心速度一般设为4500rpm/min。如果样品离心效果不佳则可以加大离心力或延长离心时间再次离心。
6.移取液体:
利用加样枪移取对应的的溶剂液体至另一个容器中;如果需要吹干浓缩的样品,则移取到干净干燥的玻璃管中;如果是取下层进行分析的样品则移取全部上层液体,利用下层进行分析。移取液体的时候请注意避免移取到不相关的液体层,以免造成污染。
7.浓缩吹干:
先利用甲醇把氮吹仪的针头进行润洗,具体方法是先打开空气压缩机的开头,先通以少量气流,把装有甲醇的容量浸泡针头前端,浸泡时间约1-2s即可。润洗针头后,把装有样品的玻璃管放在下面水浴锅的相对应的固定夹子上,再打开气流阀门,以能感觉到气流声音为准,再缓慢把针头伸到液面上方,以吹动液面为限,在浓缩吹干过程中应不断调整针头的高度,以节省吹干时间。吹干的样品以没有液体流动的判定依据,亦可在吹干后再吹大约2-3min左右。严禁在没有吹干的情况下就取下样品进行下一步操作。
8.复溶:
加入对应的复溶工作液后,再加入相应的除杂溶剂,利用涡旋仪振荡溶解,此步骤时间不宜过长,大约10s左右即可。
样本分析
1.回温平衡:
在加样之前约半小时左右,把试剂盒从冰箱中取出,放置在室温下进行平衡,平衡到用手握住试剂瓶感觉到不凉为止。如果时间匆忙的话也可以利用手握住试剂瓶进行快速回温。
2.加样:
取出相应数量的微孔板放置在板架上,然后再对板孔进行编号,再对需要稀释的抗体或酶标记物进行稀释。在板孔的前六个孔内分别加入标准品1-6,然后在剩下的板孔内加入样品分析液。然后再在每孔内加入其余需要加入的液体。盖上盖板膜以后小幅度振荡,然后放置在相应的环境中进行反应。如是25℃环境反应,则可放置在空调房内进行反应;如果是37℃环境下反应,则必须放置在37℃恒温培养箱里进行反应,如果是4℃环境下反应,则必须放置在2-8度冰箱里进行培养。
3.反应时间:
尽量把时间控制在需要的反应时间,如果时间比较紧迫的话也可以把时间稍微延长几分钟,但不宜太长。显色时间可根据颜色深浅进行调整。
3.洗板:
把板内液体甩干,加入稀释好的洗液250ul/孔,静置10s或稍作振荡后甩掉孔内液体,再次加入洗液,以此重复3-4遍,洗完以后利用吸水纸把孔内液体充分拍干后进行下一步操作,如果孔内有气泡,则利用干净的枪头刺破。
4. 结束实验:
把加样枪全部调到最大量程,试剂盒放入冰箱,试管及离心管进行清洗,关闭不用的仪器.
详细项目的SOP请见附录部分!
附录:
氯霉素
操作步骤 完成与否 1.称取3g±0.02g样本于50ml离心管中; 2.利用移液管或加样枪加入6ml乙酸乙酯; 3.盖上离心管盖,利用涡旋仪振荡1min左右; 4.把振荡好的样品对称放置于离心机中,按照4500rpm/min离心5min; 5.离心结束后小心取出样本,小心取4ml于10ml干净干燥燥玻璃管中; 6.把取出后的样本放在氯吹仪上吹至完全干燥;拿出试剂盒回温; 7.把浓缩复溶液用去离子水1:1稀释备用;可适当多稀释一点; 8.取出吹干的玻璃试管,分别加入稀释好的复溶液和正已烷各1ml; 9.把加入溶液的试管利用涡旋仪复溶,振荡10s左右; 10.把复溶好的样品试管对称放在离心机中,按照3500rpm/min离心5min; 11.小心取出离心过的样品,利用加样枪去除上层正已烷层; 12.在板架上放置需要的板孔数目,板孔数目为样本个数+6 13.把抗体利用稀释好的复溶液按1:10的比例稀释,混匀备用; 14.在前六个孔内分别加入50ul标准品1-6,其余孔内分别加入样本各50ul 15.在所有的板孔内加入50ul稀释好的抗体工作液; 16.盖上盖板膜,轻轻振荡后
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