Goosecoid基因突变及环境危险因素与先天性小耳畸形的关系.pdfVIP

Goosecoid 基因突变及环境危险因素与先天性小耳畸 形的关系1 1 1 2 虞佩 ，张娇 ，章庆国 1 东南大学临床医学院，南京（210009 ） 2 中国医学科学院整形外科医院耳再造中心，北京（100041 ） E-mail：yp2005_78@ 摘 要： 目的 探讨环境危险因素与GSC 基因与先天性小耳畸形发生的关系。方法 设计 小耳畸形相关危险因素调查表，采用病例-对照研究方法，对 43 例小耳畸形患者及对照的环 境因素对数据进行非条件 Logistic 回归分析；同时提取外周血基因组 DNA ，对GSC 基因的 三个外显子分别设计引物，经 PCR 扩增纯化后测序分析。结果 6 例患者在第二外显子的 第 197bp 处发生了 C→T 的点突变，编码氨基酸仍为酪氨酸，为同义突变；2 例患者在第三 外显子的第 125bp 处发生了 A→G 的点突变，编码氨基酸由谷氨酸变成谷氨酰胺，为错义突 变。先天性小耳畸形发生的环境危险因素主要有：患者家族史、孕早期 3 个月时的患病及服 用药物情况。结论 先天性小耳畸形的发生是由环境因素及遗传因素共同引起的；孕早期的 患病及用药可能通过引起 GSC 的突变导致畸形的发生。 关键词： Goosecoid 基因；小耳畸形；危险因素 1. 引 言 先天性小耳畸形是胚胎发育期间第一、二鳃弓发育不全所引起，常表现为外耳形态的异 常，常伴有外耳道、中耳发育不全及半侧面部的发育不良。先天性小耳畸形在我国是一种较 常见的先天畸形，发病率约为 1.4/万[1]，在头面部先天畸形中位居第二，次于先天性唇腭裂 畸形。对先天性小耳畸形的发生，一般认为是环境因素和遗传因素的作用。就遗传因素而言， 到目前为止，还没有文献报道人类先天性小耳畸形的发病究竟与哪个基因的突变有关。 Goosecoid （GSC ）基因在胚胎发育过程中尤其是在颅面部发育上起重要作用，该基因的缺 失或突变可以导致颅颌面部的多种畸形，如下颌发育不全、中耳外耳形成障碍等。其他外界 因素导致该基因无法正常表达时也可引起类似畸形。因此笔者采用比例对照研究方法探讨 GSC 基因及环境危险因素在先天性小耳畸形发生中的关系。 2. 内容与方法 2.1 调查对象 病例组为 2006 年 2 月到 2006 年 9 月期间在南京市中大医院整形外科治疗的 43 例小耳 畸形患者，其中男 33 例，女 10 例，对其父母进行调查，总计 43 对夫妇。对照组为非小耳 畸形的正常人群，按患者年龄、性别进行 1：2 的配比，共调查 86 对夫妇。 根据国内外相关资料，设计小耳畸形相关危险因素调查表，对患者及对照的父母进行问 卷调查。调查内容包括：患者及其父母一般情况，居住地环境情况，患者母亲孕前 3 个月至 生产时患病、用药及接触情况等共计 26 项危险因素。面访调查对象并填写调查表，取静脉 血 2ml，乙二胺四乙酸（EDTA ）抗凝，－20℃低温保存。 1本课题得到江苏省先天性小耳及伴随面颌畸形序列治疗的研究(H200201)的资助。 - 1 - 2.2 试验方法 2.2.1 外周血基因组 DNA 提取 采用蛋白酶K消化法，异丙醇、乙醇抽提DNA ，紫外分光光度计定量，4 ℃保存备用。 待DNA完全溶解后，取3 －5µl DNA样品，经0.8%琼脂糖凝胶电泳观测基因组DNA完整性。 以DNA测定仪测定DNA纯度和浓度，记录。要求R值（OD260/OD280 ）大于1.6，纯度大于 80%，浓度大于50µg/ml 为佳。 2.2.2 引物设计和合成 参照文献[2]，构建 GSC 基因三个外显子引物，由大连TAKARA 生物技术有限公司合成。 基因扩增引物序列如下： Exon1 (forward primer) 5’CCCACTTTAAGGCTCTGTCC 3’ (reverse primer) 5’AATTAACCAACCGGCTCCAT 3’