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　限制性片段长度多态性 RFLP 08生物科学 马静怡 王朋飞 王永涛 08生化与分子生物学 刘天资 限制性片段长度多态性RFLP 分子标记的历史 第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性） 第二代分子标记技术 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA ） AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片断长度多态性） 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP（相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代分子标记的SNP（ 单核苷酸多态性) RPLF技术的简介 个体差异差异大多数都是由于不编码蛋白质的区域和没有重要调节功能的区域发生中立突变。这些突变构成的差异成为DNA多态性。 假如DNA 顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部位的DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。这样，利用该限制性内切酶消化此DNA 时，便会产生与正常不同的限制性片段。在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP ）。 RFLP作为一种“遗传路标”，对人类基因组制图提供必要的标记，当多态性顺序与人类遗传性疾病位点连锁时，可作为遗传缺陷的产前诊断或是鉴别携带者的标记，还可以应用于亲子鉴定和群体研究等方面。 RPLF技术的原理 利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。 通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。 由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的类型 1.点的多态性 表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有 酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。Southern杂交 即可诊断。 2.序列多态性 ①由于DNA 顺序上发生突变如缺失、重复、插入所致。 ②由于高变区（highly variable region ）内串联重复顺序的拷贝数不同所产生的，其突出特征是限制性内切酶识别位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是它在基因组中的相对位置。 RFLP中应用的限制性内切酶 限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类具有特殊功能的核酸切割酶，不同的内切酶可辨认并作用于特异的DNA序列，并将 DNA切断。 常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ ,EcoRⅠ, EcoRV,XbaⅠ,而分子 记则有几个甚至上千个。分子 记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。 三种限制性内切酶 RFLP技术的步骤 不同个体DNA的提取 1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞； 2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA； 3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。 酶切 一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。 切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。 消化DNA后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。 凝胶电泳分开DNA片段 在恒定电压下，将DNA样品放在0.8～1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70－80000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。 分辨大片断的DNA需要用浓度较低的胶，分辨小片段DNA则需要浓度较高的胶。 另外为了便于测定待测DNA分子量的大小，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量DNA （DNA marker）进行电泳。 转膜 即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支