甲基丙二酰辅酶A变位酶表达载体的构建及初步表达（.doc

甲基丙二酰辅酶A变位酶表达( 常会波1△ 王立文2 李尔珍2 朱彦丽2 欧阳胜荣1 郭晋铮1 吴建新1△ (首都儿科研究所 1生化室 ；: 甲基丙二酰辅酶A变位酶; 表达中图分类号： 文献标识码：A 文章编号： The construction and expression of methymalonyl-CoA mutase （MCM） expressive vector*　 Chang- huibo，Wang- liwen，Li- erzhen，Zhu –yanli，Ouyang- shengrong，Guo –jinzhen，Wu- jianxin (1.Dept. of biochemistry, Capital institute of pediatric, 100020， Beijing, China. 2.Dept. of neurology, 100020, Beijing, China.) Abstract: Objective To clone and express MUT gene in order to study the function and mechanism of MUT gene, which could Lay the foundation?for?further study-related MUTations?on the?function of?mechanisms. Methods RNA was extracted from human lymphocytes and transcribed reversely, MUT gene was inserted into pET32a to construct fusion protein prokaryotic expression vector. The condition for induction and expression was optimized.The fusion protein　was　detected by SDS－PAGE，and Western Blot．Results　MUT gene, of 2210bp, was obtained and identified by sequencing. ＭＣＭ　fusion protein prokaryotic expression vector were constructed successfully. A protein band of about 102 kDa was detected by SDS－PAGE, and the protein was verified to be MCM by　Western Blot．Conclusion　MUT gene was cloned and expressed successfully. Key words: MCM;MUT gene;Expression Chinese Library Classification: Q33 Document code?: A 前言 甲基丙二酸血症（MMA）是先天性缺陷病中较常见的疾患，主要由甲基丙二酰辅酶A变位酶（MCM）缺陷引起。MCM以脱氧腺苷钴胺素为辅酶，催化甲基丙二酰辅酶A向琥珀酸辅酶A的代谢，该酶的缺陷会导致代谢通路障碍而引起体内的甲基丙二酸不能降解，在全身组织和脏器堆积而引起甲基丙二酸血症。 人类MCM由单一基因MUT编码，MUT基因由Ledley等于1988年克隆后约有百种突变类型被报道，多数为发生在外显子区域的碱基替换。随着研究的深入对MCM的结构和功能的探讨成为当今研究的重点之一，MUT基因表达研究将进一步揭示MUT基因在转录，翻译和重组过程中的作用国外已对部分突变进行了表达。我国对MMA的研究主要集中在临床研究，突变基因鉴定和基因诊断研究少。我们对MMA患儿突变基因的研究在国际网上未见公布MMA相关的新突变[6,7]。我虽然对MUT基因突变研究已有了新的突破，但由于基因表达等相关研究的匮乏，难以确认突变是否为致病性突变，与国外相比存在较大差距。根据国外的发展趋势，我们针对中国人特有的突变基因MCM表达1 材料和方法 1.1 菌株和试剂 表达菌株BL21(DE3)和origamiB(DE3)为本室保存,甲基丙二酰辅酶A变位酶(北京中杉金桥)。原核表达质粒pET32a (Novagen 公司)，TRIzol(北京全式金公司)，限制性内切酶BamHＩ、NcoI、Xho I、BsaI、T4DNA 连接酶(Fermentas 公司)，Taq DNA 聚合酶,pfu高保真酶，逆转录试剂盒，DNA marker 和ECL发光试