利用高效液相色谱-紫外线法检测高铜及影响下肉鸡肝脏中8-OHdG.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集 利用高效液相色谱．紫外线法检测高铜影响下肉鸡肝 脏中的8-OHdG 苏荣胜，李小桥，万婷，胡锴，刘好朋，刘传敦，唐兆新’ (华南农业大学兽医学院，广东广州510642) 摘要：本实验旨在建立高效液相色谱．紫外线检测法(HPLC．Uv)对样本中8．羟基脱氧鸟苷(8-0HdG) 进行定量分析，通过测定标志物8．羟基脱氧鸟苷的变化量探讨含铜日粮对肉鸡肝脏线粒体DNA损伤的影 响。结果表明：肉鸡肝组织中DNA损伤产生的标志物8-OhdG含量与铜的饲喂浓度及饲喂时间有明显的相 (S／N=J0)。经实验证明此方法检测范围广，灵敏度高，可用于动物组织中8-OHdG的定量分析。 关键词：8-OhdG；肉鸡；肝脏；铜；高效液相色谱．紫外线检测法 线粒体是真核细胞内重要的细胞器之一，其不仅是生物体产能的场所，也含有携带部分 遗传信息的载体—线粒体DNA。近年来，经研究已证实线粒体DNA损．伤是基因突变、细胞 癌变及个体衰老等现象的先兆【1．3】，因此DNA损．伤的标志性产物8习弪基脱氧鸟苷(8-OHdG) 的检测方法就显得尤为重要。目前可以通过一些高选择性、高灵敏度的检测手段进行检测， 记法、气质联用分析法(GC．MS)、及PY二乓振光散射法等。鉴于某些方法容易产生假阳性结 果【4】或放射性污染，而紫外线检测器具有灵敏度高、更容易推广等优点，现参考国内外大量 文献并结合本实验室条件建立一种对肉鸡肝脏线粒体中8-OHdG进行定量分析的高效液相 色谱．紫外线检测法(HPLC．UV)。 1材料与方法 1．1试剂 P1(美国IL公司)、DNaseI、碱性磷酸酶 8．羟基脱氧鸟苷标准品(sigma)、Nuclease ALP(Fermentas)、甲醇／乙醇(色谱纯)、其它试剂均为国产分析纯。 1．2仪器与耗材 安捷伦l100高效色谱仪；紫外检测器；自动进样器及柱温箱；高速低温离心机；玻璃 匀浆管；离心管等。 1．3色谱条件 依利特C18色谱柱(4．6 mmx200mm／250rma，5／rtm)：流动相：0．1mol／LKH2P04溶液 波长：260nm；柱温：25℃；流速为1．0 ml／mini进样量：201．tl。 中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中田·南昌 第七届代表大会叠学术研讨会论文集 1．4实验动物分组与处理 200只1日龄商品代AA肉鸡(购于某种鸡场，常规免疫，自由采食和饮水，24h光照)， 随机分为4组，每组50羽，雌雄各半。选用硫酸铜为试验铜源，肉鸡基础日粮根据NRC(1994) 家禽营养需要配制玉米．豆饼型基础饲粮。基础日粮对照组铜含量为Feedstuff推荐的1 lmg 应为Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)。精确计算称量所需硫酸铜的量，然后与适量玉米粉混匀，配制各试验 饲粮。 1．5样品采集与处理 分别于lO、20、30、40及50日龄每组随机抽取5只鸡剖杀后取出肝脏置于．80。C待处 理。 经反复试验摸索，肉鸡肝脏样本中线粒体DNA损伤标志物8-OHdG的提取方案按以下两 步进行：第一步按照戴纪刚等15】的方法先从肝组织中提取线粒体DNA并鉴定，简而言之即是： 取0．19冷冻肝脏组织在玻璃匀浆管中匀浆之后悬浮于5删的Triton溶解液中。温和振荡片刻 后室温放置10min。反应完毕的溶液以8000×g离心lmin，上清液即为mtDNA。小心取上清， 加入半体积Tris饱和酚(pH7．50)，温和振荡10min，再加入原上清半体积的氯仿／异丙醇 rain，以10 min轻取上层水相，加入2倍体积无水乙醇混 (24／1)，温和振荡5 000×g离心10 匀后冰浴30min，以1