5.3 血红蛋白的提取和分离[第二课时 教案](高中生物选修一教案系列).doc

课题3 血红蛋白的提取和分离 第二课时 生动 教师组织与引导 教图 复习提问：凝胶色谱法和凝胶电泳法有何区别？生答：略 师总结；从蛋白质分子的作用力看：凝胶色谱法依靠重力分离，凝胶电泳法依靠电场力分离；从洗脱的先后顺序看：凝胶色谱法首先洗脱出来的是大分子的蛋白质；凝胶电泳法首先洗脱出来的是小分子的蛋白质。 引言：血红蛋白的提取和分离的实验操作是怎样进行的呢？ --引导学生阅读教材P66实验操作,并完成学案: 二、实验操作：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 （一）样品处理 红细胞中有一种非常重要的蛋白质—血红蛋白，它有4个肽链组成，包括两个α肽链和两个β-肽链，其中每条肽链环绕一个亚铁血红蛋白基团，此基团可携带一分子氧或一分子的CO2。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。 师讲述：猪、牛、羊或其他脊椎动物的红细胞中都含有大量的血红蛋白。因此，我们可以用猪血、牛血、羊血等用来提取和分离血红蛋白。 师：选用猪、牛、羊的血液来分离血红蛋白，有什么优点？ 生答：没有细胞核，使分离过程中要除去的杂质大大减少，使实验更容易成功。 引言：提取和分离血红蛋白的第一步是收集血红蛋白溶液。即样品处理。包括三个步骤： 红细胞的洗涤。目的： 。 操作：血液样品（加入 ，防止 ） ↓低速短时间离心（500r/min、2min） 红细胞液 ↓加入生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液）、搅拌、低速短时间离心 重复洗涤三次 ↓ 红细胞（洗涤干净） 思考：①、红细胞洗涤的目的是什么？生答：去除杂蛋白。 ②、获取血液样品时，在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠，目的是什么？生答：防止血液凝固。 ③、洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？ 生答：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不致于使红细胞吸水破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，会使血红蛋白与杂质蛋白混合，加大了分离的难度。 ④、洗涤时，要做到搅拌、低速短时间离心、 重复洗涤三次。如果洗涤次数过少，会出现什么结果？离心的目的是什么？离心速度过高和时间过长，又会出现什么结果？ 生答：无法除去血浆蛋白；将血液分层，便于用胶头吸管吸出黄色血浆；使白细胞、血小板等一同沉淀，达不到分离的效果 2．血红蛋白的释放 操作：红细胞（洗涤干净） ↓加 和 红细胞破裂，释放出血红蛋白 ↓ 含血红蛋白的混合液 思考：在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？ 生答：加入蒸馏水使红细胞吸水胀破，释放出血红蛋白；细胞膜的主要成分是磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂。加入甲苯可加速红细胞的破裂，释放出血红蛋白。 3．分离血红蛋白溶液 操作：含血红蛋白的混合液 ↓高速离心（2000r/min、10min） 溶液分层（4层，从上到下依次是：无色透明的甲苯层、白色的脂溶性物质沉淀层、血红蛋白溶液、其他杂质的暗红色沉淀物） ↓滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层 ↓分液漏斗 血红蛋白溶液（红色透明） 思考：获取血红蛋白溶液后，高速离心的目的是什么？ 生答：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于分离出血红蛋白溶液。 引言：获取血红蛋白溶液，下一步要对其进行粗分离。 （二）粗分离 方法： 目的： 原理： 操作：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲认中（pH为7。0），透析12h。 思考：粗分离的方法、目的、原理是什么？ 生答：方法是透析。目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质。原理是透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。 （三）纯化 方法： 目的： 。 1．凝胶色谱柱的制作（了解、学生自学） 2．凝胶色谱柱的装填 操作：交联葡聚糖凝胶（G—75）→用蒸馏水溶胀→凝胶悬浮液→倒入色谱柱内装填→连接缓冲溶液洗脱瓶→用磷酸缓冲液（物质