同种异体神经复合体桥接修复兔坐骨神经缺损促进神经-肌结构重建和功能恢复的实验的研究.pdf

中文摘要 同种异体神经复合体桥接修复 兔坐骨神经缺损促进神经一肌结构重建和功能恢复的 实验研究 摘 要 目的：通过制做坐骨神经缺损模型，将种植雪旺细胞的 去细胞同种异体神经复合体移植桥接于坐骨神经缺损断端。 观察神经一肌结构重建和功能恢复过程。探讨种植雪旺细胞 的去细胞同种异体神经移植促进神经一肌结构重建和功能恢 复的作用和机制，从而为临床上更加合理的治疗周围神经缺 损提供理论依据。 方法：1．细胞培养：取怀孕28天的新西兰白兔，耳缘静 脉注入空气处死后迅速取胎兔。在手术显微镜无菌条件取坐 骨神经，尽量去除神经外膜及束膜。Hank’s液冲洗5遍后将 旺细胞，培养过程中利用双差速贴壁法及Arab—C(终末浓度 促进SC细胞生长。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况 并接种进行传代，收集生长良好的第二代细胞计数并应用 S．100蛋白免疫组化鉴定。2．去细胞同种异体神经移植物制 各：取成年健康新西兰白兔，分别于梨状肌下缘水平以远 切取双侧坐骨神经，作为异体神经的来源。神经萃取前先在 手术显微镜下去除表面的脂肪组织及部分神经外膜，置于4 中文摘要 中静置12h，然后置于蒸馏水中震荡，漂沈6h。如此反复， Triton—X100共作用时间为96h，4℃下保存，用于神经移植。 对萃取的神经段行石蜡切片HE染色及扫描电镜观察去细胞 的情况。3．种植雪旺细胞的同种异体神经复合体修复兔坐骨 神经缺损促进神经一肌结构重建与功能恢复的实验观察：将 注射器注射入去细胞神经段内，形成同种异体神经复合体， 然后将此复合体迅速移植到兔缺损的一侧坐骨神经(实验 组)，对照组移植未注入雪旺氏细胞的去细胞同种异体神经， 术后4周，8周，16周大体观察兔的足部溃疡形成及愈合情 况，肉眼观察神经愈合情况及靶肌肉形态变化。两组动物4， 8，16周取材前行肌电图检查，取材后测量胫骨前肌湿重并行 光镜和透射电镜观察。肌电图检查桥接段坐骨神经的潜伏期 及传导速度：光镜观察桥接段远端的腓神经的有髓纤维数 目，髓鞘，轴索，结缔组织及血管再生情况及所支配的胫骨 前肌肌纤维和运动终板结构形态改变：电镜观察神经髓鞘， 轴索，线粒体，微管，微丝，雪旺细胞等超微结构的变化。 结果：1．雪旺细胞的培养与观察：经传代的雪旺细胞在 倒置相差显微镜下计数并观察细胞形态：雪旺细胞的浓度已 X 达到1 108／ml，其典型形态呈梭形，有突起，多为双极， 偶见三个细胞突起。胞核明显，呈卵圆形。细胞呈端对端、 肩并肩、漩涡状或栅栏样排列生长。视野内仍可见少量成纤 维细胞，胞体较雪旺细胞大，扁平状外形不规则，突起短而多， 核仁明显，有2．3个核仁，颜色较雪旺细胞浅。2．去细胞神 经桥接体的观察：大体观察：神经萃取过程中可见两端及周围 有絮状物析出，萃取后神经呈淡乳白色，无光泽，其外径及 中文摘要 长度较新鲜神经稍减小，柔软，有韧性。HE染色观察：神 经纤维结构消失，红染的神经内膜呈波浪状纵形排列，形成 管柱状空隙。扫描电镜观察：神经内的轴突、髓鞘已被完全 去除，可见由胶原纤维构成的立体管状结构，部分管腔不规 则。胶原纤维仍维持原有的位置、形态及结构特征，管内并 可见膜样结构，为雪旺细胞基底膜。3．种植雪旺细胞的同种 异体神经复合体修复兔坐骨神经缺损促进神经一肌结构重建 与功能恢复的实验观察：术后4周、8周、16周两组动物手 术区局部均未出现明显的排斥反应，实验组足部溃疡愈合情 况、神经纤维数目、髓鞘及再生神经的超微结构，运动终板 的形态及靶肌肉结构的恢复均优于对照组。神经传导速度 (NCV)于术后4周时，两组均未见明显的神经传导，术后8 周、16周实验组优于对照组。胫骨前肌湿重于术后4周实验 组与对照组无明显差异，术后8周、16周实验组恢复优于对 照组。 结论：1．采用双酶消化法和双差速贴壁法培养和提纯雪 旺细胞并辅以神经生长因子(NGF)可获取足够浓度的雪旺 细胞。2．用3％TritonX．100作用96小时后可去除周围神经 中的细胞和髓鞘而保留完整的基底膜管和纤维支架结构。3． 种植雪旺细胞的去细胞同种异体神经复合体不仅能够能为 再生神经提供良好的支架作用，又能够诱导和