三)液相色谱应用技术201102.ppt

戴安中国HPLC用户培训2011年 液相色谱应用技术 提纲: 1. HPLC的广泛应用 2.色谱柱子的选择性和应用 3.色谱柱的使用和维护保养 4.液相色谱仪系统清洗 HPLC的应用领域 在医药研究中分析应用 药物分析有USP、BP、CP等标准 常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类 手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺毒性小，L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。 在兽药研究中分析应用 二.色谱柱的选择和应用 非极性或极性较小的样品可用一般的C18柱 酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的C18柱，PH范围2-9（12） 强极性化合物一般采用离子交换柱 糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPC有专用柱 正相柱-硅胶柱,-CN氰基柱,-NH2氨基柱 戴安新型柱：PA,PA II,WAX,WCX,LILIC_1,Trinity 选择柱子的重要性 不同的分析对象选择不同的柱子 不同公司有不同品牌和不同种类填料的柱子 HPLC色谱柱子品牌杂种类多 C18柱子填料末端封尾的重要性 键合相色谱柱 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的70-80% 优点∶ 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点∶ pH值不能小于2或大于8 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同 17种氨基酸标样实时记录色谱图 （虚线为流动相梯度变化曲线） 戴安C18柱应用－9种防腐剂同时分析 饮料中防腐剂分析戴安Acclaim C18柱-250 *4.6*5u 1ml/min (90/10缓冲盐和甲醇) 饮料中防腐剂分析ZorbaxC18-150*3.0*5u,0,5ml/min (93/7缓冲盐和甲醇) 各种不同的混合基质制作方式 戴安特色混合基质色谱柱 选择性可调节：同时测定碱性API药物及其对离子 WAX-1同时分离酸性、碱性和中性化合物 WAX-1同时分离酸性、碱性和中性化合物 选择性与RP柱呈正交关系 戴安WCX-1柱应用 戴安专用色谱柱 有机酸分析专用柱 – Acclaim OA 爆炸物分析专用柱 – Acclaim E1E2 表面活性剂专用柱 – Acclaim Surfactant 有机酸分析 Acclaim OA柱－分离12种有机酸 美国 EPA 8330规定的14种爆炸物检测 美国 EPA 8330规定的14种爆炸物检测 各种类型表面活性剂分析 各种类型表面活性剂分析 三.色谱柱的使用及维护保养 流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求 良好的色谱实验习惯 拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件 定期检测柱效 色谱柱的保养（一） 样品方面 样品过滤-除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品基质与色谱柱的填料是否相互作用 样品准备 色谱柱的保养（二） 流动相方面 流动相过滤-除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验） 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 配制缓冲液的所用试剂纯度要高 有机溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 有机溶剂中的杂质含量及紫外吸收 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂 流动相对样品的溶解度 有机溶剂和水的比例 液相色谱用试剂 水-用MILLIQ处理水(18兆欧)，如用屈臣氏蒸馏水或娃哈哈瓶装纯水 (必须是正宗) 有机相-乙腈、甲醇等质量要好,遇下列情况一定要用正宗进口产品 1.痕量分析 2.低波长 3.梯度分析 溶剂过滤-除去微粒 不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器以及色谱柱。 遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器和色谱柱的寿命： ??使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。 ??用滤膜过滤溶剂去除微生物。 ??每两天更换或过滤溶剂。 ??避免溶剂瓶直接日照。 溶剂准备：过滤 选择合适的滤膜 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂