实验五 重组大肠杆菌发酵生产核酸酶培养基优化研究.ppt

实验五 重组大肠杆菌发酵生产核酸酶培养基优化研究 石陆娥 shilue@126.com 实验目的 1.了解培养基配置方法。 2.掌握培养基优化方法。 实验原理 实验器材 1.菌种 重组大肠杆菌 2.培养基 LB 液体培养基（胰蛋白胨10g/L 酵母提取物5g/L 氯化钠5g/L），甘油，葡萄糖，氯化镁，硫酸铵，IPTG，卡那霉素 3.器材 紫外分光光度计，数控超级恒温槽，恒温振荡器，立式压力蒸汽灭菌器，生化培养箱，电子天平，电动离心机，恒温培养摇床，医用型洁净工作台，发酵罐 实验步骤 1.pH值对发酵的影响（1组） 配制300ml LB培养基，分装到6个250ml (50ml)锥形瓶中，分别用1M的HCl和NaOH调pH分别为（原始pH,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0）, 灭菌（121℃,20min,压力0.1Mpa），按0.5%接种比接种，放入37℃，200rpm 摇床发酵，5h后测OD值，当OD值接近0.9时，加入IPTG (终浓度为1mM)诱导22h，取样1ml离心(8000rpm,5min),沉淀中加入100ulTris-HCl缓冲液（20mM,pH7.0,20mM MgCl2）,细胞破碎，离心(10000rpm,10min，4℃),上清液即为粗酶液，测定蛋白浓度及酶活，比较培养基不同pH对核酸酶表达的影响。 2.碳源种类及浓度对发酵的影响（2－3组） 配制40ml LB培养基，分装到6根试管(5ml)中，分别在6根试管中加入甘油，终浓度分别为0g/L,3g/L, 6g/L,10 g/L,15 g/L,20 g/L，加入不同体积的水补齐体积，灭菌（121℃,20min,压力0.1Mpa），按0.5%接种比接种，放入37℃，200rpm 摇床，5h后加入50ul 100mM IPTG(终浓度为1mM)诱导22h，取样1ml离心(8000rpm,5min),沉淀中加入100ul Tris-HCl缓冲液（20mM,pH7.0,20mM MgCl2）,细胞破碎，离心(10000rpm,10min，4℃),上清液即为粗酶液，测定蛋白浓度及酶活，比较LB培养基中添加不同量甘油对核酸酶表达量的影响。（2组） 配制40ml LB培养基，分装到6根试管(5ml)中，分别在5根试管中加入葡萄糖，终浓度分别为3g/L, 6g/L,10 g/L,15 g/L,20 g/L，加入不同体积的水补齐体积，灭菌（121℃,20min,压力0.1Mpa），按0.5%接种比接种，放入37℃，200rpm 摇床，5h后各加入50ul 100mM IPTG(终浓度为1mM)诱导22h，取样1ml离心(8000rpm,5min),沉淀中加入100ul Tris-HCl缓冲液（20mM,pH7.0, 20mM MgCl2）,细胞破碎，离心(10000rpm,10min，4℃),上清液即为粗酶液，测定蛋白浓度及酶活，比较LB培养基中添加不同量葡萄糖对核酸酶表达量的影响。（3组） 3.氮源种类及浓度对发酵的影响 配制40ml LB培养基，分装到6根试管(5ml)中，分别加入不同量硫酸铵，终浓度分别为0g/L，3g/L, 6g/L,10 g/L,15 g/L,20 g/L，加入不同体积的水补齐体积，灭菌（121℃,20min,压力0.1Mpa），按0.5%接种比接种，放入37℃，200rpm 摇床，5h后各加入50ul 100mM IPTG(终浓度为1mM)诱导22h，取样1ml离心(8000rpm,5min),沉淀中加入100ul Tris-HCl缓冲液（20mM,pH7.0,20mM MgCl2）,细胞破碎，离心(10000rpm,10min，4℃),上清液即为粗酶液，测定蛋白浓度及酶活，比较LB培养基中添加不同量葡萄糖对核酸酶表达量的影响。（3组） 4.K2HPO4 浓度对核酸酶表达量的影响 配制40ml LB培养基，分装到6根试管(5ml)中，分别加入不同量的K2HPO4，终浓度分别为0g/L, 3g/L,6g/L,9g/L,12g/L，15g/L，加入不同体积的水补齐体积，灭菌（121℃,20min,压力0.1Mpa），按0.5%接种比接种，放入37℃，200rpm 摇床，5h后各加入50ul 100mM IPTG(终浓度为1mM)诱导22h，取样1ml离心(8000rpm,5min),沉淀中加入100ul Tris-HCl缓冲液（20mM,pH7.0,20mM MgCl2）,细胞破碎，离心(10000rpm,10min，4℃),上清液即为粗酶液，测定蛋白浓度及酶活，比较磷酸盐浓度对核酸酶表达量的影响。 5.Mg2+浓度对核酸酶表达量的影响 配制40ml