一种新的卡那霉素残留检测方法.pdfVIP

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnolo~，2005，25(3)：84～90 一 种新的卡那霉素残留检测方法 周勤华 张 毅 杨胜{I (中围科学院 卜海 命科学研究院q物T程研究 巾心 上海 200233) 摘要 氨基糖苷 3一O磷酰基转移酶1Ia(APH(3)一Ⅱa)具有磷酸化卡那霉素的功能，通过突变使 APH(3)一Ⅱa的催化活性丧失，同时保留与底物卡那霉素结合的功能，由此获得的突变型 APH (3)一lla具有类似于抗体的特异性结合与识别卡那霉素分子的作用 采用戊二醛交联二步法制 备了卡那霉素一辣根过氧化物酶结合物(Kan—HRP)，把纯化后的APH(3)一Ⅱa蛋 白包被到 96孔聚 苯 乙烯板上，通过竞争性ELISA的方法建立 了一种新的卡那霉素残留检测方法。通过该方法可 以检测到卡那霉素的最低残留量为 1tag／ml： 关键词 氨基糖苷 3一0磷酰基转移酶 卡那霉素 残留 检测 抗生素类药物住治疗感染性疾病方面发挥着 由于不能完成催化反应，将保持复合物状态：本研 极其重要的作用，但 由于近些年来严重滥用，导致 究通过对氨基糖苷 3一O磷酰基转移酶 APH(3)一Ⅱ 动物性食品抗生素残留问题突出：这些残留的抗 a编码基因进行突变 ，使之失去催化活性并同时保 牛素会在人体 内蓄积，敛使人体产生耐药菌株，或 留底物结合活性，利用突变的 APH(3)一Ⅱa特异性 因大是蓄积而对机体产生毒害作用。卡那霉索属 结合与识别卡那霉素分子 ，通过竞争性 ELISA方法 于氨基糖苷类抗生素，被r泛用于治疗绪 、牛、鸡等 实现抗生素残留的检测：本试验就这一方面进行 由金黄色葡萄球茼及结卡炙杆菌昕致的各种感染： 研究，从新的角度尝试和寻求一种新的快速、简单、 日前卡那霉素尚不属于禁用约物，欧共体规定的最 经济的卡那霉素残留检测方法? 大残 留限量为 150J／_g／kg一 1 材料与方法 抗生素残留检测方法很多，如微生物法 ，高 效液相色谱 ! ，色谱一质谱联用 ，E1ISA 等： 1．1 材 料 微生物检测法应用较广泛 ，但其测定时间长且tt-果 大肠杆菌 E．coliDH5a和 E．coliBI21(DE3) 误差较大：理化检测方法如高效液相色涪法、气相 由本实验室保存。带 目的基因aph(3)一Ⅱa的质粒 色谱法 、色谱一质谱连用等敏感性较高，但检测稃序 pEGFP—N1由李逸平教授惠增 ，表达载体 pT7473由 较复杂，费用较高。基于抗原抗体反应的ELISA是 龚毅教授惠增 。pfu酶、限制性 内切酶 HindⅢ、Stu 目前应用较广的一种检测方法，但抗生素为小分子 I、BamHI和 T4DNA连接酶为TaKaRa公司产 品， 化合物，特异性抗体的制备较为困难。目前高精度 dNTP购 自上海 申能博彩生物科技有限公司，辣根 抗生素残留检测试剂盒大多依赖国外进 口，由于进 过氧化物酶 、戊二醛购 自Sigma，卡那霉 素为 口试剂盒价格昂贵，很大程度上限制了它的使用。 Aii1resco公司产品，DAB、OPD购 自华美生物工程公 和抗原抗体类似，酶与底物问的结合也具有高 司，其余试剂皆为国产分析纯。PCR引物 由上海 申 度专一的特性 但与抗原抗体不同的是一旦酶所 能博彩公司合成。96孔可拆酶标板为 Coming公一j 催化的反应完成，酶将释放底物 。如果能够通过蛋 产品。 白质工程技术对特定酶分子进行改造，使其催化活 1．2 方 法 性丧失而保留与底物结合功能，则酶与底物结合后 1