Akt抑制剂SH5对胃癌细胞系BGC823增殖的影响.pdfVIP

旦盅篡笠丛!控制型!旦兰盟宦瘪塑腿丕!堡垦堡垫埴蕉鲍丝喧筮!!扭 ·2115· Akt抑制剂SH．5对胃癌细胞系BGC一823增殖的影响 周忠笑魏晰麟姚建茹1赵延鹏翟宏鹏(沈阳医学院奉天医院普外三科，辽宁沈阳110024) 【摘要] 可能与其对VEGF的调控有关。 [关键词] 胃癌细胞；Akt；SH-5；VEGF 【中图分类号】R735．2(文献标识码】A 胃癌是我国常见的消化系统肿瘤，发病率和死亡率均较 1．2．1 Aktl／2／3 高。蛋白激酶B或Akt是一种丝氨酸／苏氨酸激酶，近年来研 从收集的细胞中提取总RNA。应用AMV反转录酶，进行逆转 究表明Akt在多种肿瘤包括胃癌中被异常激活，参与细胞生 长、增殖、凋亡和分化调节，与胃癌的发生、发展密切相关…。 血管内皮生长因子(VEGF)作为目前已知的促肿瘤血管生成 Real (PerfectTime)试剂盒说明书进行Real—timePCR扩增，以 因子，对肿瘤血管生成和肿瘤生长起重要作用，但VEGF在细B—aetin作为内参。Aktl(NM 胞内的信号传导通路尚未阐述清楚。调控VEGF的信号通路 有多种，如P13K／Akt．mTOR，Ras—Raf-MEK／MRK等，其中VEGF CACACA-3’，扩增片段为134 与Akt信号通路的异常激活是否存在关联尚未明确¨J】。本研 究通过使用Akt特异性的抑制剂SH-5培养人胃癌细胞系BGC一 CCCGTCACTGATGCC一3’，扩增片段为115 823，检测下调的Akt对胃癌细胞增殖的作用，并探讨Akt信号 通路与VEGF的关系。 159 1材料与方法 1．1材料 段长度为225bp。 1．1．1 1．五2 细胞株与细胞培养人低分化胃腺癌细胞株BGC-823 Western印迹用10elll培养皿培养细胞至80％的汇 为本实验室留存。用含有10％胎牛血清、100U／mL青霉素和 合度后，用PBS洗1次，然后用细胞刮将细胞轻轻刮下来。移至 100 15 rig／m|链霉素的RPMI一1640培养液，在37℃、含5％C02的lI．1离心管中。4℃离心，然后加入300mRIPA蛋白裂解液， 饱和湿度的培养箱内培养传代。用DMSO溶解SH-5，用PBS 静置于冰上30min，期间涡旋仪振荡数次，然后4℃、 10000 稀释至2．5斗moL／L和5l^mol／L，然后用各浓度SH-5培养细胞 r／min离心，取上清即为含有总蛋白的提取液。采用 4h，逐一进行各个指标检测。 Bradford法测定提取液中的蛋白浓度。平衡各上样孔的蛋白 Hot min， 1．1．2试剂AMV反转录酶，TakaraTaqTMStart酶， 量，按每孑L30itg上样，加人SDS样品缓冲液，100℃煮沸5 SYBR@PremixDfmer Real EraserTM(PerfectTime)和RNAiso分 别购自TaKaRa公司；RIPA蛋白裂解液购自碧云天公司；Akt兔 抗人多克隆抗体、B．actin抗体和Igc二抗购自SantaCruz公司； 至浓度为5％的封闭液，室温封闭30min，再将膜与磷酸化的 WST-8检测试剂盒(CellCountingKit-8)购自南京凯基生物公 1：1 司；SH-5购自联科生物；人VEGFEUSA试剂盒购自Raybio生