蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳简易教程.docVIP

蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简易教程 一、相关仪器和试剂的准备： （一）仪器： 1、垂直电泳仪（本体、干净玻璃板、制胶架、梳子等）。 2、移液器：1000μL、100μL、10μL各一支及枪头若干。 3、一只干净小烧杯和加热大烧杯。 4、可提供500V电压的电源。 5、用于染色和脱色的容器。 6、用于加热的电炉子 7、手套一副 8、微量进样器 （二）试剂： 1、二次蒸馏水。 2、30%丙烯酰胺混合溶液。 3、1.5mol/L的Tris（pH=8.8）和0.5mol/L的Tris（pH=6.8）。 4、10%的SDS（十二烷基硫酸钠10% SDS溶液 取5g SDS，用水溶解后，注入50mL容量瓶中，定容。（SDS为有机溶剂，在配制时易起泡沫，定容时应在泡沫全部退去后再定容，以免不准确） 3、10%过硫酸铵溶液 取5g过硫酸铵，用水溶解后，注入50mL容量瓶中，定容。 4、分离胶缓冲溶液 1.5mol/L pH=8.8的Tris-HCl缓冲溶液：将18.15g Tris用98mL水溶解后，用浓盐酸调至pH为8.8，定容到100mL 5、浓缩胶缓冲溶液 0.5mol/L pH=6.8的Tris-HCl缓冲溶液：将6.0g Tris用98mL水溶解后，用浓盐酸调至pH为6.8，定容到100mL 6、分离胶（12%）和积层胶（5%）的配制 分离胶 积层胶 成分 体积（mL） 成分 体积（mL） 水 4.9 水 5.5 30%丙烯酰胺混合液 6.0 30%丙烯酰胺混合液 1.3 1.5 mol L-1 Tris（pH 8.8） 3.8 0.5 mol L-1 Tris（pH 6.8） 1.0 10% SDS 0.15 10% SDS 0.08 10%过硫酸铵 0.15 10%过硫酸铵 0.08 TEMED 0.006 TEMED 0.008 7、电极缓冲液 将6g Tris，28.8g甘氨酸和1g SDS加水溶解后，定容到1000mL，pH应为8.3。 8、考马斯亮蓝染色法溶液配制 （1）染色液：称取0.25g考马斯亮蓝（G250），加入45mL甲醇、10mL冰醋酸和45mL水，过滤后使用。 （2）脱色液（新制）：37.5mL冰醋酸、25mL甲醇加水到500mL。 9、银染法溶液配制 （1）固定液：250 mL甲醇，25 mL冰醋酸，225 mL水。 （2）敏化液：0.02%的Na2S2O3 .5H2O溶液。 （3）显影液：0.04%甲醛溶在2%Na2CO3中。 四、垂直电泳装置的组装及胶的灌制。 1、松开本体上的螺栓，拉开左右滑块，放入两块玻璃板组成凝胶室，低板的一块板向内（注：做一块板也要加上另一块板）。合上滑块，拧螺栓锁死凝胶室。 2、将上述组合放入制胶架，插入并旋转凸轮固定。 3、灌入分离胶，至距离上沿3cm处。加入约1mm厚的一层水，放置至胶凝，约40min左右。（胶要现灌现配，以免聚合） 4、分离胶凝固后，用滤纸吸干上层的水，配制积层胶，灌至上沿，插上木梳，放置约2h，凝固。 五、加样品进行电泳 1、积层胶聚合完成后，小心拔下梳子，Tris-甘氨酸电缓冲液。按预定顺序加样，每个样品的上样μL，每加完一个样品要在去离子水中洗涤注射。 将电泳装置与电源连接正极应接下槽，在凝胶上加100V电压，待染料前沿进入分离胶后将电压提高到180V继续电泳，溴酚到达分离胶的底部关闭电源。 2、将染色液倒入回收瓶中，以备下次使用，将脱色液倒入，浸泡脱色。一定时期（约2h）最好更换脱色液一次，直至条带清晰。（约2天） （二）硝酸银染色 蛋白质条带的银染是基于蛋白质中的各种基团与银离子结合，再利用甲醛使蛋白质带上的银离子在碱性环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质表面而显色。与考马斯亮蓝凝胶浸泡在中 2、清洗：用去离子水先冲洗凝胶两次，每次1 min，然后用大量去离子水反复漂洗凝胶30 min。 3、敏化：将凝胶浸泡在敏化液中，1-2 min。 4、清洗：去离子水洗涤凝胶两次，每次10 s。 5、染色：以0.1%的AgNO3溶液浸泡凝胶，轻摇30 min。 6、清洗：去离子水漂洗30 min。 7、显影：在显影液中震荡直至出现蛋白质的清晰条带。 8、终止：以1%的冰醋酸溶液终止反应。 - 2 -