CD34阳性兔真皮干细胞的体外分离培养和鉴定.pdfVIP

CD34 阳性兔真皮干细胞的体外分离培养和鉴定 袁凌伟，鲁茂森，邢帅，汉华，沈海丽，王翠芳，夏亚一 兰州大学第二医院骨科研究所，兰州（730030 ） E-mail: xiayayi@ 摘 要: 目的：探讨兔真皮干细胞的体外分离培养和鉴定方法，初步对其生长特性进行研究， 并为生物组织工程提供一种新的种子细胞及成熟的分离鉴定方法。方法：以新生新西兰大白 兔为研究对象，机械法直接分离得到真皮组织，采用酶消化法获取细胞，利用干细胞贴壁粘 附生长的特性获取高克隆细胞群，并进行传代筛选。应用流式细胞技术检测细胞周期，成骨 诱导检测其分化潜能，免疫细胞化学法检测细胞表面分子的表达。结果：原代培养的兔真皮 细胞经过连续传代培养至第3代，细胞形态均一。流式细胞仪细胞周期分析显示，在体外培 养3天%G1=55.8 ，%S=34.6。免疫细胞化学显示：细胞表面波形蛋白(vimentin)、CD34表达 阳性，细胞角蛋白19 （cytoKeratin19 ）、Ⅷ因子和巢蛋白(nestin)表达阴性。结论：新生新西 兰大白兔真皮组织中存在多能干细胞，该细胞可向成骨细胞分化，具有多向分化潜能，说明 真皮组织是间充质干细胞的又一重要来源，具有广阔的生物组织工程应用前景。 关键词:真皮干细胞；体外培养；兔 干细胞具有高度增殖和自我更新能力，经诱导可分化为多种不同靶细胞。它的多向分化 潜能给生物组织工程带来了新的契机。真皮干细胞作为干细胞的一部分，与其他间充质干细 胞相比，具有取材方便，不受部位限制，生长和更新快的优点，并且这些特性在体外培养的 时候仍然能够保持。史春梦等[1.2] 的研究证实真皮来源的干细胞具有向脂肪，软骨和骨分化 的潜能，这使真皮干细胞在结缔组织修复方面所起的重要作用开始为人们所认识。真皮干细 胞的研究起步相对较晚，现在对真皮干细胞的分离局限于人包皮和大鼠。兔是组织工程中应 用最广泛的试验动物之一，而现有的真皮干细胞移植入兔会产生免疫排斥反应，影响移植结 果。因此，体外分离培养和鉴定兔真皮干细胞在组织工程方面具有重要的实用价值。 本实验以新生新西兰大白兔为研究对象，探索分离真皮组织来源干细胞的方法，并对其 作出鉴定，为真皮干细胞的分离培养提供一种切实可行的方法，同时为后续研究的顺利进行 做了良好的铺垫。 1 材料和方法 1.1 材料 实验动物：出生2-5d 的新西兰大白兔，购自兰州生物制品研究所。培养基和免疫试剂： DMEM/F12和胎牛血清购自Hyclone公司；维生素C和地塞米松购自Sigma 公司； nestin 、Ⅷ 因子、vimentin 、cytoKeratin19，CD34 的一抗与免疫组化检测试剂盒均购自博士德生物公 司。 1.2 方法 1.2.1 真皮干细胞的分离 取出生2-5天的新西兰大白兔，引颈处死，75%酒精消毒全身，放于超净工作台上，剪 取背部全层皮肤，无菌刀片去除皮下组织，机械法分离真皮(HE切片证实) ，PBS冲洗3遍， 2左右小块置于0.25% 的胰酶中，37 ℃消化40分钟， 200 目滤筛过滤除去大块组织 剪成1mm 和碎片，置离心管中，用尖吸管充分吹打成单细胞悬液， 冰上静置20分钟，1200转/分钟离 心10分钟，接种于玻璃培养瓶。培养条件为DMEM/F12+10 %胎牛血清+0.1%青霉素和链霉 素，37℃，5%CO2 。培养1天后，轻轻弃去悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养，待长满瓶底80% - 1 - 后，0.25%胰酶消化，常规传代。取传至第3代的细胞进行研究。 1.2.2 间充质干细胞的生物学特性的鉴定 取第3代贴壁细胞，以5 ×104/孔接种于培养瓶中，按上述方法继续培养，倒置显微镜下 观察细胞生长情况( 图1)，分别于第1、2 、3、4 、5、6、7天胎盘蓝染色计数活细胞，绘制生 长曲线1(图2) ，取1，3，5天培养细胞做流式细胞周期分析( 图3)，取第3代贴壁细胞，使其在 盖玻片上生长，1 d后取出，弃去培养液，PBS轻